CAR-T细胞疗法自诞生以来就被寄予厚望，近几年其在血液肿瘤治疗领域大放异彩。然而，这一突破性细胞免疫疗法同样存在缺陷，由于受到肿瘤微环境和T细胞耗竭等因素影响，CAR-T在实体瘤治疗领域的应用无法令人满意。为加速CAR-T在实体瘤领域的临床转化，不少研究开发了限制和抗耗竭T细胞的方法，为CAR-T治疗实体瘤提供了一些新策略。
一、调节/敲除转录因子基因
近年来，已有多项研究表明多种转录因子参与调控T细胞耗竭过程，如BATF、TOX，NR4A，c-jun等。其中，转录因子BATF在T细胞耗竭中的作用颇有争议。一方面，有研究称PD-1通过上调BATF的表达而导致T细胞耗竭，也有研究表明CAR-T细胞敲除BATF提高了效应因子IL-2及IFNγ的分泌；而另一方面，有研究发现BATF的缺失降低了T细胞分泌IFNγ及增殖的能力，同时，也有研究认为BATF可以阻断CAR-T细胞的耗竭，过表达BATF使CAR-T细胞具有更强的增值能力和肿瘤杀伤能力，并产生长期的肿瘤抑制效果。
而在今年10月7日，由中国科学院动物研究所、干细胞与生殖生物学国家重点实验室、北京干细胞与再生医学研究院王皓毅团队在Cancer Cell 期刊发表的一篇题为：Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells 的研究论文中，发现转录因子BATF在CAR-T细胞耗竭过程中发挥着重要作用，敲除BATF可以提高CAR-T细胞的抗耗竭能力及形成中央记忆细胞的能力，从而产生持久有效的抗肿瘤效果。
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来源：eLifeBATF在CAR-T细胞耗竭诱导条件下的功能 （
来源：参考资料1）
在这项研究中，研究人员建立了一个体外CAR-T细胞功能缺陷模型，并通过使用该模型进行候选基因筛选，发现敲除转录因子BATF可以显著提高CAR-T细胞的体内、外抗肿瘤活性。
为了进一步验证BATF的功能，该团队通过在人的6种不同CAR-T细胞及小鼠的OT-1 T细胞中进行BATF的敲除和过表达。研究发现，在不同耗竭诱导的条件下，BATF敲除均可以提高CAR-T/OT-1 T细胞抗肿瘤活性，而BATF过表达则降低了CAR-T/OT-1 T细胞的杀伤能力。未来，在临床应用中使用BATF缺失的CAR-T细胞具有持久性和有效性优势。
值得一提的是，早在2019年，拉霍亚免疫学研究所(LJI)的科学家发表在Nature杂志上的一项研究同样表明，一种名为Nr4a的转录因子蛋白质家族在调节与T细胞衰竭相关基因方面发挥着重要作用。通过小鼠模型，科学家们证明，用缺乏这些Nr4a转录因子的CAR-T细胞治疗小鼠，可以使肿瘤变小，存活率更高。
二、给PD-L1装上“开关”
实体瘤治疗中，PD-L1的表达可能是CAR-T细胞疗效不佳的原因。为了将PD-L1的抑制信号转化为刺激信号，有多个研究组在CAR-T细胞中共同表达靶向PD-L1的嵌合开关受体(CSRs)，并发现这些CSRs增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效应。
10月13日，中国科学院广州生物医药与健康研究所李鹏团队在Nature Communications上发表的题为“Co-expression of a PD-L1-specific chimeric switch receptor augments the efficacy and persistence of CAR T cells via the CD70-CD27 axis”的一项研究论文中，该科研团队设计了靶向PD-L1的CSR分子CARP，其不含CD3ζ链，因而CARP-T细胞不具有肿瘤杀伤活性。此项研究在体外和肿瘤人源化小鼠模型中证明了CARP-T细胞能够提升CAR-T细胞的抗肿瘤活性，促进中枢记忆样CAR-T细胞的分化，同时降低CAR-T细胞IL5、IL10和IL13等Th2型细胞因子的分泌。
相关机制研究发现，CARP分子能够反式结合激活CAR-T细胞表面的PD-L1，导致CARP-T细胞与CAR-T细胞间发生连接。单细胞RNA测序发现，CARP-T细胞与CAR-T细胞间的连接促进两种细胞间CD70与CD27分子的相互作用，而CD70-CD27信号通路进一步促进中枢记忆样CAR-T细胞的分化、降低Th2类细胞因子的分泌，最终提升了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
▲ CSR -T和CAR-T细胞相互作用（
来源：参考资料2）
此外，研究发现，此类细胞间作用不局限于靶向PD-L1的CSR-T细胞，且靶向CD19的CSR-T细胞同样能够提升共表达CD19分子CAR-T细胞的抗肿瘤活性。研究表明，CSR分子反式结合CAR-T细胞表面靶抗原后可通过CD70-CD27信号通路提升CAR-T细胞的疗效和持久性。目前，该研究处于基础研究阶段。
▲CARP T细胞通过CD70-CD27增强CARMz T细胞的功效和持久性（
来源：参考资料2）
三、构建双靶点嵌合抗原体系
在今年6月，李鹏课题组与暨南大学李扬秋课题组合作，在Molecular Therapy – Oncolytics上发表了题为“DAP10 integration in CAR-T cells enhances the killing of heterogeneous tumors by harnessing endogenous NKG2D”的研究。该研究设计了一种串联DAP10的嵌合分子。该嵌合分子可利用T细胞上的天然NKG2D受体靶向表达NKG2D配体的肿瘤细胞；之后将其与抗GPC3单链可变片段（scFv）串联，构建双靶点嵌合抗原体系，发现表达串联GPC3-DAP10嵌合受体的T细胞表现出双抗原靶向作用，在体内外可明显抑制异质性肿瘤细胞生长。
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来源：参考资料3
四、免疫检查点和癌症治疗靶点抑制/敲除
2022年3月，澳大利亚莫纳什大学的研究人员在 Cancer Discovery 期刊发表了题为：PTP1B Is an Intracellular Checkpoint that Limits T-cell and CAR T-cell Antitumor Immunity 的研究论文。该研究将蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）确定为细胞内免疫检查点和癌症治疗靶点，PTP1B在肿瘤内T细胞中高表达，缺失或抑制PTP1B可增强T细胞抗肿瘤活性并增加CAR-T细胞对抗实体瘤的有效性。
在此项研究中，研究团队在小鼠模型中进行了验证试验，发现抑制PTP1B，能够增强癌细胞对PD-1抑制剂的反应。具体来说，T细胞特异性的PTP1B缺失或抑制增加了STAT5信号传导，这增强了抗原诱导的CD8+T细胞的扩增和细胞毒性作用，从而实现对肿瘤生长的抑制。更重要的是，PTP1B的缺失或抑制可以显著增强CAR-T细胞杀伤实体瘤（包括乳腺癌）的能力，这为CAR-T细胞疗法治疗实体瘤提出了新的方法。
▲ 抑制PTP1B可增强CAR-T细胞治疗有效性（
来源：参考资料4）
同样，2022年10月，在Nature杂志上发表的一项题为“RASA2 ablation in T cells boosts antigen sensitivity and long-term function”的研究论文中，研究人员借助基于CRISPR的筛选文库确定了一种预防T细胞功能障碍的靶点基因——RASA2。并利用CRISPR基因编辑技术，对T细胞进行了基因改造，创建了RASA2基因敲除的T细胞。通过将这些T细胞反复暴露于癌细胞以及肿瘤微环境模型中，对其进行各种“应激测试”。发现这种新设计的T细胞对抗原具有更高的敏感性，击杀效率比传统的T细胞更高，并且能够存活更长的时间，持久地发挥抗肿瘤作用。
▲ RASA2敲除改善了功能性T细胞的效力持久性 （
来源：参考资料5）
此外，在2020年，一篇由宇繁生物首席科学官廖学斌与中山大学魏来发表在Cancer Cell 的研究论文中，证明了潜在的癌症免疫治疗靶点造血祖细胞激酶1（HPK1）的表达水平与患者肿瘤浸润T细胞衰竭正相关性，以及HPK1表达与癌症患者较差生存率之间的负相关性。该研究也阐明了HPK1是调控CAR-T细胞疗效的关键激酶，HPK1由基因MAP4K1编码。
▲ HPK1机制意图（
来源：参考资料6）
研究团队探讨了HPK1对CAR-T细胞功能的调控，在CD19+，Her2+及BCMA+肿瘤模型中发现与WT或PD-1敲除的CAR-T细胞相比，MAP4K1敲除的CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤效应：细胞耗竭程度降低、更低的毒性、更长的持续性、增加的浸润性。
五、细胞因子助力CAR-T
2022年6月，T细胞治疗公司NeoImmuneTech在Nature Communications杂志上发表的一项将长效人源细胞因子IL-7（NT-I7 ）与针对 CD19 + B细胞淋巴瘤和急性髓性白血病的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞联合使用的体内研究结果中指出，NT-I7显著增加了 CAR-T 细胞的扩增和持久性。NT-I7（efineptakin alfa）是该公司的主要候选药物。
此项研究利用B细胞淋巴瘤或急性髓系白血病的复杂模型，以及急性早幼粒细胞白血病的免疫活性同源模型，以研究NT-I7对体内CAR-T细胞扩增和抗肿瘤反应的影响。最终结果表明，NT-I7增强了CAR-T疗法对急性髓性白血病和B细胞淋巴瘤的疗效，显著延长了小鼠模型的生存期，并显著增加了CAR-T细胞的扩增和持久性，使输注时所需的CAR-T细胞最少数量减少至少五倍。这些令人信服的数据证明NT-I7通过促进CAR-T抗肿瘤活性、扩展和持久性，有可能增强CAR-T治疗血液病的疗效。
▲ 在小鼠体内显著增强UCART19 的扩增、持久性和抗肿瘤功效（
来源：参考资料7）
六、靶向蛋白质“刹车”提高CAR-T治疗效果
2021年，根据发表在Science Immunology上的研究结果，居里研究所的科学家团队在小鼠模型中采用全基因组CRISPR-Cas9筛选，将蛋白质SOCS1确定为抑制CD4+ T细胞增殖和存活的重要“刹车”。SOCS1确定通过在IFN-γ和IL-2信号传导下游起作用的因素，以抑制CD4 +的关键节T细胞增殖、存活和效应子功能。
研究人员通过在患有膀胱肿瘤的小鼠进行测试，用抗肿瘤活性CD4+T细胞以及SOCS1失活的T细胞对其进行治疗后发现，SOCS1缺失的T细胞比对照细胞更有效地浸润肿瘤近十倍。
此外，SOCS1在调节CD8+T细胞方面也发挥着作用。在患有黑色素瘤的小鼠模型中观察到，与对照T细胞相比，敲除了SOCS1的肿瘤特异性CD8+T细胞对肿瘤产生了显著且持久抑制作用。研究团队发现，在进入肿瘤的敲除了SOCS1的T细胞中，有更多数量的细胞毒性分子和效应T细胞，这可能解释了其强大的抗肿瘤作用的原因。
结语
尽管当下CAR-T细胞治疗取得了显著进展，但CAR-T细胞在患者体内的有限持久性依然是一个挑战。而为了进一步扩大CAR-T细胞的临床应用，一些制药企业也在积极探索与尝试增加其CAR-T候选产品的持久性的方法，如通过CAR结构的优化、CAR-T中装载溶瘤病毒等等。虽然迄今为止的结果仍然有限，但近几年与之相关研究越来越多，基于以上各类研究，也或将为各大药企带来一些新的启示。相信不久的将来，终将会突破这一瓶颈，使CAR-T细胞疗法更广泛应用于实体瘤患者。
转自：“博舜科研”微信公众号
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