导读
西洋参（Panax quinquefolium L., AG）是一种具有多种心血管保护作用的中药。这些年来，人们在 AG 中发现了许多生物活性成分；然而，研究者们对这些抗心力衰竭活性的关键药效学成分的理解是不够的。我们利用AB系野生斑马鱼（Danio rerio）建立心力衰竭模型，评价AG的抗心力衰竭活性。我们通过基于超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱-质谱技术（UHPLC-QE-Orbitrap-MS）的非靶向代谢组学分析对AG样品中的差异组分进行了筛选，使用斑马鱼模型验证了其潜在的活性成分；同时，我们利用网络药理学和分子对接技术预测了可能的机制。最后，我们使用定量实时聚合酶链反应 (Q-PCR) 技术在斑马鱼中验证了六种关键药效学成分的关键靶点。通过盐酸维拉帕米处理，我们成功建立了受精后（hpf）斑马鱼幼鱼48 h的心力衰竭模型。斑马鱼试验表明，AG的抗心力衰竭作用因产区而异。基于 UHPLC-QE-Orbitrap-MS 的草药代谢组学分析结果表明，人参皂甙Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙Rg6、苹果酸、奎尼酸、L-精氨基琥珀酸、3-甲基-3-丁烯基-芹糖(1→ 6) 葡萄糖苷、拟人参皂苷 F11 和番荔枝碱是差异成分，可能是导致疗效变化的原因。我们使用斑马鱼模型、网络药理学和 Q-PCR 技术进一步分析表明，人参皂甙 Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙 Rg6、苹果酸、奎尼酸和拟人参皂甙F11是抗心力衰竭的药效学标志物（P标志物）。我们使用斑马鱼模型和代谢组学技术快速鉴定了 AG 中抗心力衰竭的P标志物。这些P标志物可能为AG的质量控制和新药开发提供新的参考标准。
论文ID
原名：Identification of key pharmacodynamic markers of American ginseng against heart failure based on metabolomics and zebrafish model
译名：基于代谢组学和斑马鱼模型的西洋参抗心力衰竭关键药效标志物鉴定
期刊：Frontiers in pharmacology
IF：5.988
发表时间：2022.10
通讯作者：王松松，韩立文
通讯作者单位：山东第一医科大学与山东省医学科学院
实验设计
实验结果
1. 各地区西洋参样品抗心力衰竭效果评价
表1列出了 AG 样本及其收集时间，Q-PCR 检测的引物序列见表 2。模型组斑马鱼心包面积、静脉充血面积、SV-BA距离（静脉窦和动脉球之间的距离）较对照组显着增加（p < 0.01），说明盐酸维拉帕米处理成功地诱导斑马鱼心力衰竭。我们用阳性药物地高辛处理后，斑马鱼心脏的静脉充血面积和SV-BA距离显着逆转（p <0.05）。与模型组相比，S6、S12 和 S14 治疗组的斑马鱼心包面积显着减少（图 1C）。然而，与模型组的斑马鱼相比，S8、S13 和 S15 治疗组斑马鱼的心包面积没有显示出差异。治疗后，与模型组相比，S6、S8、S10、S12、S14和S15治疗组斑马鱼静脉充血得到缓解（图1D）。我们的结果表明，相较于模型组，所有 AG 样本均显着降低了各自组别斑马鱼心脏的 SV-BA 距离（除 S15 外）（图 1E）。如图 1F 所示，S13 对心力衰竭的改善率最低，S6 和 S10 的改善率较高。
表1 AG 样本的采集信息
表2 Q-PCR 分析的引物序列
图1 从不同地区收集的 AG 抗心力衰竭活性的比较。 (A) 斑马鱼心力衰竭实验药物治疗示意图； (B) 斑马鱼心脏的表型显微照片； (C) 斑马鱼心脏心包面积的统计结果。 n = 10; (D) 斑马鱼心脏静脉充血面积的统计结果。 n = 10; (E) 各组斑马鱼心脏中SV-BA的统计结果。 n = 10; (F)不同地区AG样本心力衰竭改善率的比较。心力衰竭改善率=（A1+A2+A3）/3，A=（Φ-a）/Φ*100%，Φ：模型组平均值，（A）样本组值； ##p < 0.01 与对照组相比； *p < 0.05 和 **p < 0.01 与模型组相比。
2. 非靶向代谢组学筛选西洋参潜在活性成分
我们对原始数据进行预处理以获得总离子色谱图的叠加图（图 2A、B），使用保留时间的校准曲线可视化校准过程。此外，峰的保留时间应在可用标准中观察到的保留时间的 ± 0.2 分钟保留时间窗口内。如图 2C、D 所示，AG 样品的峰符合标准。经XCMSonline软件预处理后，我们共得到4535个正离子模式p<0.01的色谱峰和2668个负离子模式色谱峰。
图2 AG 样品的总离子色谱图叠加图。 (A) 正离子模式下校正的总离子色谱图； (B) 负离子模式下校正的总离子色谱图； (C) AG样品在正离子模式下的保留时间偏差图； (D) AG样品在负离子模式下的保留时间偏差图。
我们将12批AG的MS数据输入OneMap进行主成分分析。如图3A所示，PCA散点图由正离子模式下的第一主成分（53.2%）和第二主成分（11.8%）构成。我们观察到从两个区域获得的AG样品明显分离，表明两组的某些化合物不同。在负离子模式下，第一和第二主成分分别为 53.1% 和 15.3%（图 3D）。 AG样品与散点图没有完全分离，因此需要进一步建模和分析。
图3 AG代谢组学数据的多变量统计分析。 (A) 正离子模式下的 PCA 散点图； (B) 正离子模式下的 OPLA-DA 散点图； (C) OPLA-DA 在正离子模式下的 S 图； (D) 负离子模式下的 PCA 散点图； (E) 负离子模式下的 OPLA-DA 散点图； (F) OPLA-DA 在负离子模式下的 S 图； (G) 人参皂苷 Rg6 的 MS2 光谱。
在主成分分析之后，我们使用有监督的 OPLS-DA 进一步分析这两组之间的差异。如图 3B 所示，E OPLS-DA 分析可以显着区分来自两个区域的 AG 样本。正负离子模型中R2Y(cum)和Q2(cum)的值分别为0.98、0.85、0.92和0.84，表明OPLS-DA模型具有良好的可测性和适用性。置换检验验证了 OPLS-DA 模型是否过拟合。 PT 的结果是 R2 = (0.0, 0.21) 、 Q2 = (0.0, -0.51) 、 R2 = (0.0, 0.33) 和 Q2 = (0.0, -0.65)。 Q2值与纵坐标的回归线交点小于零，左侧所有Q2值均小于右侧最高值，说明了模型的可用性。 VIP 值 > 1.5，p < 0.05，并且 |pcorr| > 0.58 用于筛选可能重要的碎片离子（表 3）。结果使用 OPLA-DA 模型的 S 图表示（图 3C，F）。我们通过标准物质或 MS/MS 数据确定了总共九种潜在重要成分对心力衰竭的保护作用（表 4）。化合物 3 是展示化合物结构识别过程的一个例子。化合物 3 测定了 m/z 767.4917[M + H]+ 的准分子离子；因此，我们推算出的分子式为C42H70O12，误差为3.7 ppm，与人参皂苷Rg6的分子式一致。 MS/MS显示，与文献数据相比，我们得到了明显的m/z 605.4393、587.4288、569.4183、443.3870和425.3762碎片离子，推断碎片离子为m/z 605.4393 [M + H-Rha]+； 587.4288 [M + H-Rha-OH]+； 569.4183 [M + H-Rha-2OH]+； 443.3870 [M + H-Rha/Glc]+和 425.3762 [M + H-Rha/Glc-OH]+。因此，化合物 3 被推测为人参皂甙 Rg6（图 3G）。
表3 筛选 AG 的潜在活性成分对抗心力衰竭
表4 使用 UHPLC-QE-Orbitrap-MS 鉴定来自 AG 的不同活性成分
3. 斑马鱼模型对已鉴定生物活性化合物的生物活性评价
我们使用斑马鱼模型验证代谢组学筛选的潜在差异成分。其中，人参皂甙Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙Rg6、苹果酸、奎尼酸和拟人参皂甙F11可显着改善盐酸维拉帕米处理斑马鱼引起的心力衰竭。人参皂甙 Rg3、人参皂甙 Rg6、奎尼酸和拟人参皂甙 F11 可以改善斑马鱼心脏心包面积、静脉充血面积和 SV-BA 距离的扩张。人参皂甙 Rg5 和苹果酸仅改善斑马鱼心脏的静脉充血。不同浓度的 L-精氨基琥珀酸并未改善斑马鱼的心力衰竭（图 4）。
图4 人参皂甙 Rg3、人参皂甙 Rg5、人参皂甙 Rg6、苹果酸、L-精氨基琥珀酸、奎尼酸和拟人参皂甙 F11 的抗心力衰竭活性验证。（A-G）斑马鱼心包区的统计结果。 n = 10; （A'-G'）斑马鱼心脏静脉充血面积统计结果。 n = 10; (A”-G”) 斑马鱼心脏 SV-BA 距离的统计结果。 n = 10。##p < 0.01 对比对照组，*p < 0.05 和 **p < 0.01 对比模型组。
4. 生物活性化合物作用机制的网络预测
人参皂甙Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙Rg6、苹果酸、奎尼酸和拟人参皂甙F11的靶点和调控途径如图5A-5F所示。结果表明，这六种化合物可分别靶向α7烟碱型乙酰胆碱受体（CHRNA7）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARA）、Bcl-2样蛋白1（BCL2L1）、肝细胞生长因子受体（MET）、成纤维细胞生长因子 1 (FGF1) 以及参与多种信号通路的信号转导和转录激活因子 3 (STAT3)。此外，结果表明分子对接中的结合能很高。苹果酸靶向两个靶点，即法尼基二磷酸法尼基转移酶 1 (FDFT1) 和 CHRNA7。奎尼酸靶向两个途径和七个靶点，包括 PPARA、脂肪酸结合蛋白 2 (FABP2) 和 FABP3。在网络预测分析中，人参皂苷Rg3靶向BCL2L1，这是信号通路中的关键靶点。 MET 编码肝细胞生长因子 (HGF) 的受体酪氨酸激酶 c-MET，这是人参皂甙 Rg5 对抗心力衰竭的重要靶点。人参皂甙 Rg6 靶向 6 个靶点和 4 条通路，正如拟人参皂甙 F11 所执行的那样。
图5 抗心力衰竭和分子对接二维图的 C-T-P 网络。（A-F）人参皂苷 Rg3、奎尼酸、人参皂苷 Rg6、拟人参皂苷 F11、苹果酸和人参皂苷 Rg5 的 C-T-P 网络； (A'-F') 生物活性分子的分子对接二维图； (A”-F”) 正分子的分子对接二维图。
预测靶点及相关分子对接信息见表5，显示了六种药效化合物的作用模式及其对应的对接靶点（图5A'~5F'和5A“~5F”）。苹果酸的结合能（-4.117 kcal/mol）低于附着在受体上的阳性对照分子。羧基与 Val99 和 GLN103活性部位中的两个氨基酸残基形成氢键。奎尼酸与 PPARA 靶标的结合能为 -7.835 kcal/mol。虽然奎尼酸的结合能低于与受体结合的分子的结合能，但奎尼酸的结合能很高，因为在ASN219 和 LEU331活性部位中，它涉及羟基和两个氨基酸残基之间形成三个氢键。人参皂苷Rg3的结合能与附着在受体上的阳性对照分子的结合能略有不同。碳 20 的羟基和人参皂苷 Rg3 的糖苷部分与活性部位的三个氨基酸残基（TYR108、ARG146 和 GLN118）形成三个氢键。人参皂甙 Rg5 在活性部位中的四个氨基酸残基（ASP1164、GLU1082、LYS1161 和 TYR1159）与极性糖苷部分的葡萄糖环结构上的羟基之间形成五个氢键。人参皂苷Rg6的结合能为-5.438 kcal/mol，高于受体FGF1配体。人参皂苷Rg6主要在活性不问中的两个氨基酸残基（GLY4126和LYS4113）与极性部分糖苷上的羟基之间形成三个氢键。拟人参皂苷 F11 与氨基酸残基形成两个氢键。
表5 对接蛋白的化合物信息
5. 西洋参关键化合物抗心力衰竭相关基因表达
为了阐明关键活性化合物对斑马鱼心力衰竭的改善作用的机制，我们通过 Q-PCR 分析确定了参与调节心力衰竭的基因的 mRNA 水平（图 6）。与对照组相比，维拉帕米处理组FGF2、VEGFA和STAT3的mRNA水平显着升高（p < 0.01）。模型组FGF1、PPRA、CHRNA7 mRNA表达较对照组有中度升高。用人参皂甙 Rg3 处理可抑制 FGF1 和 STAT3 的 mRNA 表达水平（p < 0.05）。与维拉帕米处理的斑马鱼相比，人参皂苷Rg5处理显着降低了FGF2的mRNA表达水平（p < 0.05），而VEGFA的mRNA表达水平与模型组相比无统计学意义。人参皂甙Rg6处理明显减弱模型组FGF2和VEGFA的mRNA表达水平（p < 0.05）。人参皂苷F11处理组FGF1、VEGFA、FGF2的mRNA表达水平显着低于模型组（p < 0.05）。奎尼酸和苹果酸对 PPARA 和 CHRNA7 的 mRNA 表达没有显着影响，但这两种成分分别降低了 PPARA 和 CHRNA7 的 mRNA 表达水平。
图6 潜在活性化合物对心力衰竭相关基因表达的影响。（A-F）用人参皂苷 Rg3、奎尼酸、苹果酸、人参皂苷 Rg6、人参皂苷 Rg5 和拟人参皂苷 F11 处理的斑马鱼基因表达结果，##p < 0.01 与对照组相比，*p < 0.05 和 **与模型组相比，p < 0.01。
讨论
据报道，西洋参作为一种补气的中药，对心脏有保护作用。因此，我们建立了斑马鱼心力衰竭模型作为评估本研究中 AG 主要活动的工具。作为介于细胞和哺乳动物之间的新型脊椎动物模式生物，斑马鱼近年来被广泛应用于心脏保护药物的筛选。本研究采用钙离子阻滞剂盐酸维拉帕米对斑马鱼进行处理，建立了心力衰竭药物快速筛选模型。 AG广泛分布于北纬37°附近的低山地区，如北美五大湖区、中国东北、华北地区。中国目前有四个产区：东北、陕西、北京和山东。研究表明，AG的生长受气候、温度、水、土壤等环境因素的影响。我们的研究发现，由于生长环境不同，AG在这四个产区的抗心力衰竭活性存在差异。
各种案例研究报告称，AG 中的许多成分对心脏具有保护作用。目前，已鉴定的人参皂苷是人参属植物的主要次生代谢产物。人参皂甙 Re 可改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心力衰竭。人参皂甙 Rh2 可改善 1 型糖尿病大鼠的心脏纤维化。人参皂甙 Rb1 通过抑制线粒体复合物 I 的 ROS 产生来减轻心肌缺血/再灌注损伤。本研究筛选人参皂甙Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙Rg6、苹果酸、奎尼酸和拟人参皂甙F11作为AG的P标志物。值得注意的是，人参皂甙 Rg6、拟人参皂甙 F11 和奎尼酸的抗心力衰竭活性首次被报道。
药效标志物（P-marker）是在中药质量标志物（Q-marker）的基础上提出的一个新概念。P标志物是中药发挥部分或全部药效作用的关键成分。P标志物和Q标志物的区别在于后者是反映中药质量的标志物，而前者侧重于与生物活性直接相关的标志物。本研究综合了斑马鱼模型和代谢组学的优势，建立了“组分-活性”一体化研究策略的新模式，可以快速发现与特定活性相关的标志物。这一策略在我们之前的研究中已经应用于栀子药效成分的研究。
网络药理学是一门集药理学、生物信息学、物理化学为一体的新兴学科。网络药理学的出现为中药多成分、多靶点的研究提供了新的方法。网络药理学技术可以实现多成分靶点识别，对已知或新药成分进行靶点预测。本研究发现的药效成分与FGF1、FGF2、VEGFA、STAT3、BCL2L1等靶点高度相关，网络药理学预测为后续深入验证提供依据。
斑马鱼的表型和基因表达结果可以部分揭示本研究中发现的P标记的潜在作用机制。 FGF1、FGF2和 VEGFA被认为是刺激内皮细胞增殖和促进血管生成的重要因素。此外，STAT3 的结构激活也可以促进血管生成。在目前的研究中，维拉帕米处理的斑马鱼中 FGF1、FGF2、VEGFA 和 STAT3 mRNA 表达的增加表明它们可能对启动心脏损伤中的血管生成作出反应。人参皂甙Rg3、人参皂甙Rg5、人参皂甙Rg6和拟人参皂甙F11预保护后，斑马鱼的心脏损伤得到缓解，我们推测这些成分可能在心力衰竭早期就通过参与调节心脏血管生成和早期心脏自我修复来保护心脏。 PPRA 是葡萄糖转运的关键调节剂。心力衰竭激活 PPARA 以调节脂肪酸代谢并为心肌细胞提供能量。经奎尼酸对斑马鱼进行预保护后，我们观察到 PPARA 的低 mRNA 表达，表明心力衰竭期间 PPARA 的激活改善了心肌功能和能量学。我们的数据表明，奎尼酸对抗心力衰竭可能与调节脂肪酸代谢给心肌细胞提供能量有关。作为线粒体途径中凋亡的关键调节因子，BCL2L1 是促进细胞存活的常见抗凋亡蛋白。 MET 是 HGF 的酪氨酸激酶受体，主要激活促生存途径，比如防止细胞凋亡。人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg5和拟人参皂苷F11处理后BCL2L1和MET的mRNA表达增加，表明这三种成分可能通过抑制细胞凋亡来保护心肌细胞免受损伤，从而改善心力衰竭。乙酰胆碱与巨噬细胞上表达的 CHRNA7 结合，将促炎物质极化为抗炎亚型。 STAT3 通过抑制促炎基因转录而发挥抗炎作用，启动有效的修复机制。经苹果酸、人参皂甙Rg3、拟人参皂甙F11预保护后，CHRNA7、STAT3 mRNA的表达降低，提示苹果酸、人参皂甙Rg3、假人参皂甙F11的心脏保护作用可能与炎症反应的激活有关。
结论
总之，我们使用斑马鱼模型和代谢组学技术确定了 AG 中抗心力衰竭的六个关键 P 标志物。本研究为发现和鉴定中药潜在活性成分提供了一种新策略，与传统研究模式相比具有优势。这些结果可能有助于评估 AG 的内部质量。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.909084/full
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