Nature Protocols | 优化单细胞组合索引技术让低成本、大规模单细胞转录组测序成为可能

相较于普通转录组，单细胞测序转录组可以反应不同细胞类型的差异，具有高度的准确性和特异性，能够以最小的样本起始起始量开展无偏差的高通量研究。然而，由于取材的限制及高昂的设备和试剂成本使得实验室对单细胞测序技术望而却步。2017年，科学家在秀丽隐杆线虫中开发了一种组合索引策略（sci-RNA-seq）分析单细胞转录组并且不需要物理分离每个细胞，该技术首先将组织切片置于96或384孔板，将细胞透化，RNA被代表位置信息的barcode序列标记；再将板子中的细胞混合，经过流式细胞仪的分选至96或384孔板中。

sci-RNA-seq结合了原位分子索引和“分裂池”框架，用一种独特的核酸条形码组合标记指数级扩增的细胞或细胞核，然而sci-RNA-seq在不同的组织中效果不同，且灵敏度较低。近日，美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系的Jay Shendure教授在国际著名期刊Nature Protocols在线发表了题为“Optimized single-nucleus transcriptional profiling by combinatorial indexing”的研究论文，该论文优化了sci-RNA-seq步骤，且灵敏度更高，试剂成本更低。简单的说，sci-RNA-seq首先将固定细胞或细胞核分配到一个或多个96孔板的孔中，在反转录使用的 oligo-dT后加入index1，细胞或细胞核聚集并分裂后在index1后加入index2，细胞或细胞核再次聚集并分裂；之后第二链合成，用Tn5转座酶标记双链产物，PCR扩增后加入index3，最后对文库进行纯化和测序。

优化后的sci-RNA-seq为了扩大组织样本范围，最主要的改变是针对更好地中和在较老的胚胎和成人组织中发现的内源性rna酶，作者发现DEPC可以很好地代替RNase Alert并且不损害转录读出，且极大地降低了成本。并且该方法取代了原来的核悬浮缓冲，使核在洗涤和自旋过程中得到更好的恢复。更多优化详细步骤可见原文：

https://www.nature.com/articles/s41596-022-00752-0

优化后的sci-RNA-seq与目前市面上商业化的单细胞测序技术相比其优点在于可以大规模在实验室开展，成本较低，开源，不需要工具包，可成倍扩展。但也有其局限性，细胞裂解使用的是细胞核的通用方法，可能会丢失细胞质转录本。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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