Nat Immunol：在B细胞急性淋巴细胞白血病中，NUDT21通过替代mRNA聚腺苷酸作用限制CD19水平

背景

B细胞祖细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL)治疗已经通过基于T细胞的免疫疗法发生了革命性变化，包括嵌合抗原受体T细胞疗法 (CAR-T)和双特异性T细胞接合治疗剂疗法，靶向表面糖蛋白CD19的博纳吐单抗。然而控制细胞表面CD19丰度的基因调控程序仍不清楚，且许多B-ALL患者会因为抗原逃逸了抗白血病T细胞靶向的白血病CD19的丢失或缺失而导致免疫治疗将失败。

简介

2022年9月22日，来自美国纽约大学医学院的Matthew T. Witkowski及其团队在Nat Immunol (IF: 20.479)杂志上发表名为NUDT21 limits CD19 levels through alternative mRNA polyadenylation in B cell acute lymphoblastic leukemia的研究[1]。

主要结果

为了在转化的人B细胞中鉴定跨膜糖蛋白CD19表面丰度的调节因子，我们将基于B细胞表面CD19丰度的全基因组聚集的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR-Cas9)筛选和流式细胞仪分离相结合。我们产生了五种表达Cas9的CD19+ B细胞系，包括三种B-ALL (Reh、NALM6和697)和两种来自慢性淋巴细胞白血病 (HG3)和B细胞淋巴瘤 (TMD8)的成熟B细胞肿瘤细胞系 (图1a)。使用囊胚素可选择的Cas9构建体的慢病毒转导实现了稳定的Cas9表达。然后用Brunello全基因组单向导 (sg)RNA库转导杀稻瘟菌素耐药的Cas9+细胞系，用绿色荧光蛋白 (GFP)表达跟踪sgRNA表达细胞。使用基于CD19表面蛋白流的分选策略，我们分离了GFP+CD19lo和GFP+CD19hi B细胞，然后对sgRNA进行深度测序，以生成z评分标准化的“CD19 CRISPR评分”，代表CD19lo细胞内每个基因的sgRNA的平均评分 (CD19激活剂；靶向CD19激活剂的sgRNA会导致CD19表达缺失，CRISPR评分为阴性)和CD19hi细胞 (CD19阻遏物；与非靶向对照sgRNA相比，靶向CD19阻遏物的sgRNA会增加CD19表达，导致CRISPR评分为阳性)。

为了鉴定高置信度和细胞系特异性CD19调节因子，我们为所有五个试验细胞系选择了前200名CD19激活因子和前200名CD19抑制因子 (图1b)。因此，我们鉴定了Cas9+Reh、Cas9+697和Cas9+NALM6细胞特有的22种CD19激活物和6种CD19抑制物，以及Cas9+HG3和Cas9+TMD8共有的5种CD19激活物和3种CD19抑制物 (图1c，d)。在所有五种人Cas9+ B细胞系中，我们观察到CD19lo群体中CD19 sgRNA显著富集 (图1b)。与通过分泌通路发生的CD19蛋白成熟一致，内质网和高尔基体相关蛋白如CD81、CANX和SEC61A1在Cas9+Reh、Cas9+697和Cas9+NALM6系中被鉴定为CD19激活剂 (图1c，d)。大多数B-ALL CD19激活剂，包括分别促进CD19启动子激活和CD19内含子2排除的PAX5和PTBP1 (图1c，d)，都与CD19的基因组调控和mRNA加工有关。B-ALL中CD19激活剂的基因集富集分析 (GSEA)表明与TAF1和YY1蛋白复合物的亚基重叠 (图1e)，这是RNA聚合酶II介导的转录起始所必需的。

图1. 全基因组CRISPR筛选识别人类B细胞恶性肿瘤中的CD19调控因子

然后，我们试图通过将B-ALL中CD19调节因子的基因表达模式与多种原代人造血细胞类型的CD19 mRNA表达模式相关联，来鉴定支持CD19表达的基因调控网络。使用来自4份健康和7份诊断B-ALL人类骨髓标本的单细胞RNA-seq (scRNA-seq)数据 (图3a)，我们证实了人类B细胞祖细胞在白血病骨髓样本中的过度表达 (由Seurat参考数据集定义为Prog_B 1和Prog_B 2) (图3b)。与所有其他表达CD19的细胞群体 (包括幼稚B细胞、记忆B细胞和浆母细胞)相比，CD19 mRNA的表达仅限于在健康和B-ALL Prog B _ 1 (以高EBF1和MKI67为特征)和Prog _ B 2 (以高CD19、PAX5、EBF1和MKI67为特征)亚群中表达最高的B细胞谱系 (图3c)。值得注意的是，CD19 mRNA的表达在白血病相关的Prog _ B 2细胞中最高 (图3c、d)。对健康和白血病条件下CD19hi Prog _ B 2区室中各个候选基因的表达进行排序，结果显示，PAX5 (一种已知的CD19激活因子)的mRNA表达以及RNA结合蛋白NUDT21的转录产物与CD19 mRNA表达显著相关 (图3d)。在健康和白血病Prog_B 1和Prog_B 2的B细胞祖细胞亚群中，NUDT21 mRNA表达与CD19 mRNA呈正相关，而在幼稚和记忆B细胞中，这种显著相关性降低 (图3e)。我们还发现NUDT21蛋白的丰度与CD19hi NALM6 B-ALL细胞中的CD19蛋白表达呈正相关，这些细胞根据CD19的表达情况分为四分位数 (图1a和3f，g)。

图3. NUDT21在人类B细胞祖细胞中高度表达

NUDT21通过识别前mRNA分子3′-UTR中pA位点上游的5′-UGUA-3′序列，促进前mRNA 3′-末端切割和聚腺苷酸化 (pA)。为了了解NUDT21在CD19 mRNA处理中的作用，我们分析了基于Cas9+NALM6细胞、基于CRISPR的外显子突变数据集。SgRNA靶向包含NUDT21 RNA结合结构域的核苷酸水解酶结构域导致了较高的CD19 CRISPR评分，表明该结构域参与了CD19 mRNA的抑制。为了评估CD19 mRNA是否与NUDT21直接相互作用，我们在Reh、697、NALM6和TMD8细胞中进行了NUDT21结合mRNA的增强交联沉淀 (eCLIP)。在Reh、697和NALM6细胞中检测到CD19 mRNA上的显著NUDT21结合峰，但在TMD8细胞中未检测到 (图4e)。NUDT21结合的全局分析在Reh、697和NALM6细胞系共有的1264个编码基因上鉴定出26609个显著峰。NUDT21结合未在3′-UTRs处特异性富集，大部分NUDT21峰被定位于内含子和外显子区域，这可能反映了在主动转录期间与RNA聚合酶II和mRNA前加工机制的直接相互作用。

图4. NUDT21直接抑制CD19 mRNA的稳定性和蛋白表达

结论及展望

在本研究中，我们采用了全基因组CRISPR Cas9筛选方法来鉴定人B-ALL原始细胞上的CD19丰度调节剂。这些研究确定了转录激活因子ZNF143在CD19启动子激活中的关键作用。相反，RNA结合蛋白NUDT21通过调节CD19信使RNA的多聚腺苷酸化和稳定性来限制CD19的表达。B-ALL细胞中NUDT21缺失增加了CD19的表达以及对CD19特异性CAR-T和博纳吐单抗的敏感性。在接受CAR-T和博纳吐单抗治疗的人类B-ALL患者中，NUDT21 mRNA的上调与疾病复发时CD19的丢失同时发生。总之，这些研究在人B-ALL中确定了新的CD19调节剂。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41590-022-01314-y

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

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