肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是多种病因导致肝细胞发生变性、炎症及坏死等，进而刺激肝细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）合成与降解失调，造成肝脏内的纤维结缔组织异常增生、沉积而引起的一系列病理、生理过程[1]。其本质是由于肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）活化及ECM合成与降解不平衡，导致ECM过度沉积；主要表现为广泛的肝细胞坏死、ECM过度沉积引起的正常肝组织破坏、假小叶和再生结节形成，最终导致门脉高压相关性疾病、低蛋白血症等多种严重并发症的产生[2]。尽管现代医学对HF的发病机制研究颇深，但目前大多数抗HF药物的临床效果不显著，且具有药物毒性，其实际应用受到限制。因此，开发有效的药物逆转HF进程，是治疗慢性肝病，预防肝硬化、肝癌的关键。
龙血竭是百合科植物龙血树属植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen的含脂木材经乙醇提取而得到的树脂，被誉为“活血圣药”，有散瘀生新、活血止痛、止血生肌等功效，在治疗冠心病、脑梗死、心肌缺血以及抗炎、创伤愈合等方面具有显著的疗效[3]。研究表明，龙血竭具有抗血栓、抗血小板聚集、抗纤维化等作用[4]。本课题组前期通过生物信息学方法，筛选出龙血竭中抗纤溶酶原激活物抑制因子-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的活性成分高车前素，其生物活性强于龙血素B[5]。高车前素是一种黄酮类化合物，现代药理学研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗增殖、抗真菌、抗癫痫、抗诱变、抗肿瘤、保肝、抑制血管生成等多种药理活性[6]。高车前素可能通过Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，抑制磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）和Twistl蛋白表达，从而抑制抗凋亡的B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bc1-2）蛋白表达，抑制肝癌细胞增殖[7]。JAK1/STAT3信号转导通路是细胞因子信号转导通路之一，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等多种重要的生物学过程。研究发现，JAK1/STAT3信号通路与HF有着极其密切的联系，但其具体的作用机制尚不明确[8-10]。因此，本研究采用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导建立HF小鼠模型，初步考察高车前素对小鼠肝功能指标、纤维化相关指标和肝脏病理学改变等的影响，探讨高车前素对HF小鼠JAK1/STAT3信号通路的影响，为其临床应用提供思路。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性昆明种小鼠80只，6～8周龄，体质量18～22 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（渝）2018-0003。动物饲养于重庆医科大学实验动物中心IVC第二动物房，每笼饲养不多于5只，自由进食饮水，室温22.0～23.1 ℃，相对湿度52%～60%。动物实验经重庆医科大学医学研究伦理委员会批准（批准号2022072）。
1.2 药品与试剂
高车前素（批号DSTDG002601，质量分数为99.23%）购自成都德斯特生物技术有限公司；秋水仙碱片（0.5 mg/片，批号20200802）购自滇红药业集团玉溪生物制药有限公司；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒（批号AUZ2122）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒（批号AUZ2119）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）试剂盒（批号AUZ2130）均购自贝克曼库尔特商贸有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20210906）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号20210927）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒（批号20211009）、羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）试剂盒（批号20211124）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）试剂盒（批号20210918）、层黏连蛋白（laminin，LN）试剂盒（批号2021091）、III型前胶原（type III procollagen，PIIINP）试剂盒（批号20210909）、IV型胶原（type IV collagen，Col-IV）试剂盒（批号20211101）均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号E20210301A）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（批号E20210312A）、IL-6 ELISA试剂盒（批号E20210407A），购自上海继锦化学科技有限公司；PAI-1、尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，uPA）引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RNA simple Total RNA试剂盒（批号W0103）购自天根生化科技有限公司；RT Master Mix for qPCR（批号99152）、SYBR Green qPCR Master Mix（批号115209）购自MCE公司；全蛋白提取试剂盒（批号20211210）购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒增强型（批号P0010）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（批号P0012）、一抗稀释液（批号P0023）均购自碧云天生物技术有限公司；β-actin抗体（批号ab169795）、JAK1抗体（批号ab126315）、p-JAK1抗体（批号ab126413）、STAT3抗体（批号ab163709）、p-STAT3抗体（批号ab163518）均购自英国Abcam公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体（批号BST17C18B17D54）、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（批号BST17C08A17C50）购自博士德生物工程有限公司；发光液（批号2104602）购自美国Millipore公司；Western blotting Marker（批号01081673）购自PageRuler公司；CCl4（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、二甲苯、中性树胶等均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器
CLW-1020型纯水机（重庆乾崃仪器有限公司）；Allegra X-12型离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；Mias-2000型病理图象处理系统（四川大学图象处理国家研究所）；AU480型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；756PC型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；ST360型酶标仪（上海科华实验系统有限公司）；Mastercycler® nexus型实时荧光定量PCR仪（德国Eppendorf公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂公司）；ChemiDoc XRS＋型全自动化学发光凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。
2 方法
2.1 造模、分组及给药
参照文献方法[11-14]，取65只雄性昆明种小鼠，背部sc现用现配的40% CCl4橄榄油溶液（10 mL/kg），2次/周，连续6周，制备HF小鼠模型，另取15只小鼠作为对照组。分别取5只模型小鼠和5只对照小鼠，检测血清中肝损伤指标（AST、ALT）活性，并进行肝脏病理学观察，确定模型复制成功。造模过程中动物死亡20只，将剩余40只HF小鼠随机分为模型组、秋水仙碱（2 mg/kg）组和高车前素高、低剂量（30、10 mg/kg）组，每组10只。各给药组ip相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ip等体积生理盐水，1次/d，连续4周。末次给药后，小鼠禁食不禁水24 h，称定体质量，摘眼球取血，取肝脏组织，用PBS缓冲液冲洗3次，称定肝湿质量，计算肝脏指数[15-16]。
肝脏指数＝肝湿质量/体质量
2.2 各组小鼠血清中肝功能相关指标测定
各组小鼠摘眼球取血后，离心分离血清，采用全自动生化分析仪测定血清中ALT、AST活性及TBIL水平。
2.3 各组小鼠血清中HF相关指标测定
取各组小鼠血清，按ELISA试剂盒说明书测定血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平。
2.4 各组小鼠肝组织中SOD活性及MDA、GSH水平测定
取各组小鼠肝脏，用预冷的生理盐水洗去浮血，用生理盐水研磨成10%的肝组织匀浆，4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上清，按试剂盒说明书测定SOD活性及MDA、GSH水平。
2.5 各组小鼠血清和肝组织中Hyp水平测定
按试剂盒说明书测定各组小鼠血清和肝组织中Hyp水平。
2.6 各组小鼠肝组织中炎症因子水平测定
按ELISA试剂盒说明书测定各组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
2.7 各组小鼠肝组织病理观察
取各组小鼠肝大叶相同部位的小块肝组织，于10%甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡常规包埋后切片（4～5 μm厚），进行苏木素-伊红（HE）染色，自然晾干后中性树胶封片，于光学显微镜下观察肝组织病理改变。
2.8 各组小鼠肝组织中uPA和PAI-1 mRNA表达
取各组小鼠肝组织，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析[17-18]。引物序列为uPA上游引物5’-AAAACAGTAATCCC- TACGAA-3’，下游引物5’-TTTAATGAGGAGTACT- GGAC-3’；PAI-1上游引物5’-TGTCCCTTCTACA- GGG-3’，下游引物5’-GGGTTACAGCACTTGGA- CG-3’；β-actin上游引物5’-TTGTGAGACCCAATC- CG-3’，下游引物5’-AGATTTCTGAGCCGCAAG-3’。
2.9 各组小鼠肝组织中JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达
取各组小鼠肝组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，于冰上充分裂解，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，TBST洗涤5 min，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，室温封闭1 h；分别加入p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3和β-actin抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤10 min，洗涤3次，加入二抗（1∶10 000），室温封闭2 h；TBST洗涤10 min，洗涤3次，加入ECL发光试剂显影，采用Image J软件分析条带灰度值[8-10]。
2.10 统计学方法
采用SPSS 22.0进行统计分析，计量资料采用描述，选用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性分析；计数资料采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）进行显著性分析。
3 结果
3.1 高车前素对HF小鼠体质量和肝脏指数的影响
如表1所示，与对照组比较，模型组小鼠体质量明显下降（P＜0.01），肝脏指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠体质量均显著升高（P＜0.05、0.01），肝脏指数明显降低（P＜0.05、0.01）。
3.2 高车前素对HF小鼠血清中肝功能指标的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST活性和TBIL水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中ALT、AST活性和TBIL水平均显著降低（P＜0.05、0.01），提示高车前素对HF小鼠肝损伤有一定保护作用。
3.3 高车前素对HF小鼠血清中HF相关指标的影响
如表3所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中LN、HA、PIIINP和Col-IV水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中LN、HA、PIIINP和Col-IV水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.4 高车前素对HF小鼠肝组织中抗氧化相关指标的影响
如表4所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中MDA水平明显升高（P＜0.01），SOD活性和GSH水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织中MDA水平明显降低（P＜0.01），SOD活性明显升高（P＜0.05、0.01），GSH水平呈升高趋势。
3.5 高车前素对HF小鼠血清和肝组织中Hyp水平的影响
如表5所示，与对照组比较，模型组小鼠血清和肝组织中Hyp水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清和肝组织中Hyp水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.6 高车前素对HF小鼠血清中炎症因子水平的影响
如表6所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著降低（P＜0.05、0.01），提示高车前素可通过抑制促炎细胞因子的表达，从而发挥抗HF的作用。
3.7 高车前素对HF小鼠肝组织中uPA和PAI-1 mRNA表达的影响
如表7所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中uPA mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），PAI-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，高车前素高、低剂量组小鼠肝组织中uPA mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），PAI-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），秋水仙碱组小鼠肝组织中uPA和PAI-1 mRNA表达均无显著差异。
3.8 高车前素对HF小鼠肝组织病理变化的影响
如图1所示，对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝索呈放射状，肝小叶和汇管区形态结构完整、轮廓清晰，无炎细胞浸润及纤维组织增生；模型组小鼠肝小叶和肝细胞结构紊乱、不规则，出现明显水肿，肝细胞体积变大，呈空泡样变性，可见肝细胞坏死、炎细胞浸润和明显纤维间隔形成；与模型组比较，各给药组肝细胞排列趋于正常，细胞水肿、空泡样改变、炎细胞浸润明显减轻，提示高车前素对CCl4致HF小鼠肝组织损伤具有明显的保护作用。
3.9 高车前素对HF小鼠肝组织中JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响
如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中p-JAK1和p-STAT3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，高车前素低剂量组小鼠肝组织中p-JAK1和p-STAT3蛋白表达水平均显著降低（P＜0.001），提示高车前素抗HF的作用机制可能与下调JAK1/STAT3信号通路有关。
4 讨论
近年来，HF的发病率越来越高，已成为目前备受关注的社会健康问题，亟待利用我国中医药资源的优势，加强中药抗HF机制研究。CCl4可通过直接破坏肝细胞膜，造成肝细胞损伤坏死，长期给药可导致HF、肝硬化和肝癌，其病理组织学变化与人类HF相似，现已被广泛用于抗HF药物的研究。
本研究采用sc CCl4建立HF小鼠模型，结果显示，模型组小鼠肝脏指数、血清ALT、AST活性及TBIL水平以及血清和肝组织中Hyp水平均显著升高，肝组织MDA水平显著升高，肝组织SOD活性和GSH水平明显降低，同时血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，这些细胞因子的不断刺激又可进一步加重肝损伤，形成恶性循环，导致HF的发生发展。高车前素能够显著降低血清中ALT、AST活性和TBIL水平，下调血清和肝组织中Hyp水平，降低血清中MDA水平并升高SOD活性，且对GSH水平有上调趋势；此外，高车前素能够降低肝脏指数和血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，使肝细胞排列趋于正常，细胞水肿、空泡样改变、炎细胞浸润明显减轻。提示高车前素可有效减轻CCl4诱导HF模型小鼠的肝损伤和炎症程度，具有明显的保肝作用。
PAI-1作为一种单链糖蛋白，由379个氨基酸残基组成，属于丝氨酸蛋白酶家族，通过与纤溶酶原激活物丝氨酸活性中心结合，使其活化作用丧失。PAI-1是专一抑制纤溶酶原激活的抑制剂，在生理条件下，PAI-1通过形成复合物来抑制uPA和组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA），从而阻止纤溶酶的形成。PAI-1在肝脏中主要由巨噬细胞、肝窦细胞和HSC表达。在正常肝脏中PAI-1含量很低，肝部分切除后再生细胞中的PAI-1含量升高。研究发现，PAI-1与HF的发生关系密切，随着纤维化的加重，PAI-1含量增加，抑制PAI-1表达可以有效抑制HSC活性。PAI-1可阻止uPA激活纤溶酶原，降低基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性，导致ECM在肝细胞内过多沉积，PAI-1还可以诱导细胞分化为活化的成纤维细胞[19]。在PAI-1过表达小鼠中纤维蛋白沉积和器官纤维化增加[20]，而PAI-1缺陷小鼠中HF减弱[21]。CCl4诱导的HF小鼠模型中，PAI-1在HF进程中持续上调，可能参与Col-I、Col-III的表达调控，在HF的发生中起重要作用，从而证实了PAI-1可促进HF时基质蛋白的合成[22]。临床实践表明，HA、LN、PIIINP和Col-IV 4项指标是临床判断HF的重要血清学指标，其水平与肝组织炎症活动及纤维化均呈正相关[23]。本研究发现，模型组小鼠血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平显著升高，同时小鼠肝组织中uPA mRNA表达水平显著降低，而PAI-1 mRNA表达水平显著升高，说明CCl4引起了小鼠肝组织的损伤及纤维化；给予高车前素干预后，小鼠血清中HA、LN、PIIINP和Col-IV水平均显著下降，肝组织中uPA mRNA表达水平显著上调，PAI-1 mRNA表达水平显著下调，表明高车前素具有抗HF作用，其作用机制可能与激活uPA纤溶酶系统有关。
JAK/STAT信号通路是一条由细胞转导刺激的信号通路，参与细胞的生长、分化以及免疫调控等生物学过程，主要由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT组成。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、IL-4、IL-6、瘦素、生长激素和γ干扰素等细胞因子均能激活这一通路，其中最主要刺激因子为PDGF，当PDGF与受体结合后，会磷酸化JAK1，继而磷酸化STAT3，之后与受体分离进入核内，激活靶基因转录和表达，直接促进HSCs生长和分裂，提示JAK1/STAT3信号通路在HF的形成过程中发挥了重要的调控作用，抑制JAK1/STAT3信号通路的转导和激活可延缓HF的进展。本研究结果显示，高车前素低剂量组小鼠肝组织中p-JAK1和p-STAT3蛋白表达水平均显著降低，表明高车前素抗HF的作用机制可能调节JAK1/STAT3信号通路相关因子有关。
综上所述，高车前素可有效减轻CCl4诱导HF小鼠的肝损伤和炎症程度，其抗HF的作用机制可能与激活uPA纤溶酶系统和干预JAK1/STAT3信号通路有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：徐 冲，秦小东，任 丽，罗先钦．基于JAK1/STAT3信号通路研究高车前素对肝纤维化小鼠的影响 [J]. 中草药, 2022, 53(19): 6093-6100 .
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