导读
芩翘消毒方(QQXD) 是一种中药 (TCM) 配方，已用于临床治疗流感病毒性肺炎。然而，QQXD对流感病毒性肺炎的作用和机制尚不清楚。因此，本研究从肠道菌群和代谢的角度探讨QQXD治疗流感病毒性肺炎的作用机制。结果表明，QQXD能够降低流感病毒小鼠的死亡率、体重减轻、肺病毒载量、肺指数和肺损伤的情况。细胞因子阵列发现 QQXD 减弱了血清IL-1α、IL-4、IL-12(P70) 和 TNF-α 的表达。随后，16s rRNA基因测序表明QQXD可以增加Gemmiger、Anaerofustis、Adlercreutzia和Streptococcus的相对丰度，并降低Dehalobacteriu、Burkholderia、Prevotella、Butyrimimonas、Delftia等的相对丰度。同时，靶向代谢谱分析表明，QQXD可以调节氮代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。相关分析表明，QQXD对氰基氨基酸代谢途径的调节作用与流感小鼠中Parabacteroides, Pediococcus, 和Clostridium的丰度变化有关。总之，我们的研究表明，QQXD 可以抑制流感病毒复制，抑制细胞因子风暴，保护小鼠免受流感病毒感染性肺炎。这些机制可能与改善肠道菌群失调、增加肠道碳水化合物代谢和上调氰基氨基酸代谢途径有关。
论文ID
原名：Qin-Qiao-Xiao-Du formula alleviate influenza virus infectious pneumonia through regulation gut microbiota and metabolomics
译名：芩翘消毒方通过调节肠道菌群和代谢缓解流感病毒感染性肺炎
期刊：Frontiers in Medicine
IF：5.058
发表时间：2022.10
通讯作者：刘清泉，徐霄龙
通讯作者单位：首都医科大学
实验结果
1.芩翘消毒方血清主要成分的鉴定
小鼠口服方剂30、60、90 min后，我们采用UPLC-MS法鉴定QQXD方的主要生物活性成分。样品的总正离子和负离子色谱图说明了 QQXD 含药血清的主要生物活性化合物（图 1）。其中，有18种是主要化合物，包括甘草苷、黄芩苷、桔梗素D、黄芩素、汉黄芩苷、甘草酸和甘草次酸等。QQXD 的具体成分见补充表 1。
图1 UPLC-MS/MS 在正离子模式和负离子模式下的总离子色谱图 (TIC)。(A) 样品 30 分钟。(B) 样品-60 分钟。(C) 样品-90 分钟。
2.芩翘消毒方对流感小鼠体重、存活率、肺病毒载量和肺指数的影响
结果显示，对照小鼠体重没有减轻。流感病毒感染后，模型（病毒感染组）、奥司他韦（阳性对照组）、QQXD-L（低剂量QQXD处理组, 221 pfu, 9.1 g/kg/d）、QQXD-M（中剂量QQXD处理组, 221 pfu, 18.2 g/kg/d）、QQXD-H（高剂量QQXD处理组, 221 pfu, 36.4 g/kg/d）组体重明显减轻（图 2A）。流感病毒感染会导致体重显着下降，使用奥司他韦和 QQXD 可以控制。
图2 QQXD 对流感小鼠体重减轻、存活率、肺病毒载量和肺指数的影响。(A) 体重变化。(B) 存活率。(C) 肺病毒载量。(D) 肺指数。*p < 0.05，**p < 0.01。
在生存试验中，对照或奥司他韦均未报告死亡。在流感病毒感染的第7天，模型组报告了 2 例死亡，QQXD-L 和 QQXD-H 各报告了 1 例死亡。第八天，模型组报告 6例死亡，QQXD-L报告7例死亡，QQXD-M报告5例死亡，QQXD-H报告6例死亡。 QQXD-H的其中1只老鼠死亡，是排除了药物和感染的原因的。奥司他韦和 QQXD 治疗的小鼠免受致命感染。模型组中50%的小鼠存活，而QQXD-M和QQXD-L中有68.75% 和 53.33%的小鼠存活（图 2B）。
我们通过使用流感小鼠的肺病毒载量评估了 QQXD 对流感病毒的抑制作用。在流感病毒感染小鼠肺组织后的第五天，病毒在肺组织中大量复制。模型中肺病毒载量显着增加，而QQXD-L、QQXD-M和QQXD-H显着降低肺病毒载量（图2C），差异具有统计学意义。 QQXD 能够减少小鼠肺部的病毒载量。
流感病毒感染了小鼠的肺组织，造成了显着的肺损伤，包括肺水肿和肺出血，导致小鼠肺的重量显着增加。我们采用肺指数和肺组织苏木精-伊红染色观察QQXD对流感小鼠肺损伤的影响。模型组中小鼠肺指数显着升高，而奥司他韦、QQXD-L、QQXD-M、QQXD-H显着降低小鼠肺指数，差异有统计学意义（图2D）。
3. 芩翘消毒方对血清炎性因子及肺组织的影响
流感病毒感染引起炎症因子反应。本研究发现白细胞介素1α（IL-1α）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素12（P70）[IL-12（P70）]、肿瘤坏死因子-α（TNF -α) 模型组显着增加（图 3A-D），QQXD 可显着降低 IL-1α、IL-4 和 TNF-α，差异有统计学意义（图 3A-D）。
图3 QQXD 对流感小鼠炎症因子和肺组织病理学的影响。(A) IL-1α。(B) IL-4。(C) IL-12(P70)。(D) TNF-α。(E) 肺组织的苏木精-伊红染色；bar= 100 微米。*p < 0.05，**p < 0.01。
我们采用苏木精伊红（H&E）染色观察QQXD治疗对流感小鼠肺组织病理变化的影响（图3E）。对照组出现肺损伤，支气管、血管周围间隙及叶间隔增宽，而肺泡无明显损伤。模型组中肺组织明显受损，肺泡结构破坏，支气管上皮脱落，管壁血管扩张充血，有炎性细胞浸润，大量核细胞浸润肺泡壁。在QQXD组中，肺泡结构受损，也观察到支气管上皮渗漏，但不如模型组中严重。
4. 芩翘消毒方对流感小鼠肠道菌群组成的影响
菌群的 DNA 片段在 Illumina MiSeq/NovaSeq 平台上进行测序。我们对物种进行分类和注释，比较不同样本和组间OTUs和分类地位鉴定结果的差异；通过稀疏变换测量的样本丰度，以获得每个分类级别的每个样本中的微生物群落（图 4A）。
图4 QQXD 治疗的流感小鼠肠道菌群的组成和多样性。(A) 各级微生物分类单元数量统计图。对照组：C1-C6；模型组：M1-M6；QXXD组：Q1-Q6。(B) 属级物种组成直方图。(C) 辛普森指数。(D) 香农指数。(E) 基于 Jaccard 的 PCoA 3D。(F) 基于 Jaccard 的2D PCoA。***p < 0.01。
在对组内的样本丰度进行归一化后，我们分析了属水平的物种丰富度。对照以Lactobacillus为主，模型以Lactobacillus和Oscillospira为主，QQXD以乳酸杆菌和拟杆菌为主。模型组和QQXD 中的Lactobacillus显着下调（图 4B）。
香农多样性指数考虑了菌群的丰富性和均匀性。辛普森指数是一种常用的指数，通过计算两个随机抽样的个体（序列）属于不同物种（ASVs/OTUs）的概率来评估群落多样性。辛普森指数越高，菌群越多样化。香农指数/辛普森指数值与群落多样性成正比。本研究发现模型组中肠道群落的多样性高于对照组和QQXD组（图4C，D）。 Chao1 估计量和观察到的物种丰富度用于评估群落的丰富度。 Chao1 估计量和观察到的物种丰富度越大，群落丰富度越高。谱系多样性（PD指数）表明了新添加的 ASV/OUT 与群落中另一个物种之间的关系。菌群之间的关系与 Faith 的 PD 指数成正比。 Pielou 均匀度指数反映群落均匀度，Pielou 均匀度指数与群落均匀度成正比。 Good 的非参数 coverage 估计分析通过测序评估菌群中物种的覆盖率，Good’s coverage指数与未检测到的物种的比例成反比。本研究发现模型组中肠道群落的丰富度高于对照和QQXD（补充图1A，B）。模型组中的菌落相关性较远，肠道群落更均匀，与对照和 QQXD 不同（补充图 1C，D）。对照组、模型组和 QQXD 未检测到低比例的物种（补充图 1E）。主坐标分析（PCoA）用于对多维微生物数据进行降维，数据变化的主要趋势通过样本在连续排序轴上的分布来表现。 Jaccard 距离通过计算样本中所有物种中非常见物种的比例来显示不同样本之间的差异。本研究发现对照组、模型组和QQXD的肠道群落组成在相应维度上不相似，三组之间存在差异（图4E，F）。
5.差异菌群筛选及功能通路分析
本研究比较了三组间 ASV/OTU 丰度的差异。结果显示，对照组、模型组和 QQXD 中有 4,457、13,555 和 8,746 个独特的 ASV/OTU，而三组中有 861 个 ASV/OTU（图 5A）。我们分析了三组样品中的植物群丰度，发现模型组中的植物群丰度较高。我们使用平均丰度中前 50 个属的丰度数据绘制热图。结果表明，在模型中，Dehalobacteriu、Burkholderia、Prevotella、Butyricimonas、Delftia、Ochrobactrum、[Prevotella]、Oscillospira、Butyricoccus、Roseburia、Bifidobacterium、Coprococcus、Methylobacterium、Bilophila、Prauserella、[Ruminococcus]、Polynucleobacter、Alistipes、Agrobacterium、Phyllobacterium、Staphylococcus, Megamonas的丰度增加，但在对照和QQXD中减少。 Gemmiger、Anaerofustis、Adlercreutzia、Streptococcus 的丰度在模型组中减少，而在对照和 QQXD 中增加（图 5B）。我们进行 Lefse 分析以发现三组之间的稳定差异物种。在本研究中，线性判别分析 (LDA) 设定为大于 2，p < 0.05。 QQXD 为Erysipelotrichi、TM7_3、CW040 等。模型组为 S24_7、Oscillospira、Ruminococcaceae 等（图 5C）。在本研究中，我们对模型组和QQXD差异菌群应用随机森林分析，得到了重要的差异菌群，主要包括Dehalobacterium、Prevotella、Bilophila等（图5D）。
图5 差异菌群和通路富集分析。(A) 差异菌群的维恩图。(B) 属级物种组成簇热图。红色块表示该属在该样品中的丰度高于其他样品，蓝色块表示该属在该样品中的丰度低于其他样品。(C) 标记物种的 LDA 效应值直方图。 (D) 属水平的前 20 个重要植物群。(E) KEGG 次要功能通道丰度图。(F) QQXD 和模型 KEGG 代谢途径之间的差异。横轴logfc为正值表示QQXD相对于模型上调[log2（倍数变化）]，负值表示下调；纵坐标是不同KEGG代谢途径的标签；用不同的颜色显示重要程度。
我们通过Picrust2软件的群落系统发育研究获取了三组代谢途径的丰度数据，并分析了KEGG代谢途径。结果表明，三组样本菌主要在转运与分解代谢、膜转运、信号转导、复制与修复、感染性疾病、外源生物降解与代谢、内分泌系统等方面显着丰富（图5E）。在本研究中，在获得代谢途径的丰度数据后，研究了组间差异显着的代谢途径。与模型组相比，QQXD上调氰基氨基酸代谢和光合作用天线蛋白（图5F）。
6. 芩翘消毒方对流感小鼠代谢物种类及丰度的影响
我们使用 UPLC-MS/MS 系统对 21 个样品中 228 种代谢物的绝对浓度进行了靶向测量，主要包括脂肪酸、氨基酸、胆汁酸和有机酸（图 6A）。我们分析了所有样品中代谢物，发现碳水化合物、氨基酸和短链脂肪酸 (SCFA) 占主导地位。 QQXD 和模型组中 SCFAs 的代谢显着下降，QQXD 中碳水化合物代谢增加，而模型组中有机酸和脂肪酸增加（图 6B）。
图6 代谢物组成、成分分析和组间差异代谢。(A) 代谢物类别及构成比统计饼图。 (B) 三组各种代谢物的中值相对丰度的统计堆叠直方图。(C) 三组 PCA 分数图和对应的主成分箱图。 (D) QQXD 与模型组一维代谢物火山图的比较。阈值设置 p < 0.05 和 | log2fc | ≥ 0（FC，倍数变化）。
我们采用多维统计分析和主成分分析（PCA）对三组主成分进行分析。结果表明，三组主成分之间存在差异（图6C）。我们通过模型和QQXD之间的一维统计分析，总共获得了94种差异代谢物（图6D）。
7.筛选差异代谢物和分析代谢途径
在这项研究中，我们选择了 94 种最显着的差异代谢物。在 QQXD 比较模型中，吲哚-3-羧酸、 吲哚-3-甲醛、isoalloLCA 和 4-羟基苯甲酸减少（图 7A），3-羟基苯乙酸、天冬氨酸、苏氨酸、高丝氨酸和 n-乙酰色氨酸增加（图 7A ）。对照组和QQXD对差异代谢物单维和多维获得的数据进行交叉选择，以选择具有生物学意义的潜在生物标志物。筛选标准：一维分析 p < 0.05，|log2FC| ≥0且多维分析VIP>1，共获得93个潜在生物标志物，我们选用小鼠KEGG数据库进行通路分析。结果表明，氨酰-tRNA生物合成、氮代谢、赖氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成存在差异（图7B）。
图7 差异代谢物和途径分析。(A)差异代谢物小提琴图。(B) 路径分析气泡图。
8.靶向代谢组学与肠道菌群的相关性分析
我们对13种属级差异菌群和30种不同代谢物进行Spearman相关分析，以确定QQXD对肠道菌群的影响以及流感小鼠的代谢关系（图8），在 307 个微生物-代谢物对中观察到强相关性 (p < 0.05)。我们发现 QQXD 对流感小鼠的处理增加了Parabacteroides, Pediococcus和Clostridium的丰度，影响了减少的代谢物吲哚-3-羧酸、 吲哚-3-甲醛、isoalloLCA、4-羟基苯甲酸、 3-吲哚丙酮酸, 6 ,7-二酮石胆酸、壬酸、AMP 和 2-羟基己酸，以及增加的代谢物 3-羟基苯乙酸、天冬氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、N-乙酰色氨酸、葡萄糖、柠檬酸、吲哚丙烯酸、邻苯二甲酸、乌头酸、原儿茶酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、3,4-二羟基氢肉桂酸、天冬酰胺、甘氨酰亮氨酸、葡糖二酸、N-乙酰丙氨酸、N-乙酰酪氨酸和吲哚-3-乙酸甲酯。 Prevotella、Butyricimonas、Mucispirillum、Dehalobacterium、Bilophila 和 Clostridium对流感小鼠的代谢有影响。
图8 肠道微生物群与目标代谢谱之间相关性分析的热图。*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001。
讨论
在本研究中，我们确定了口服QQXD方后血浆中的18种主要活性化合物，包括甘草素、黄芩苷、汉黄芩苷、桔梗素D、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、烯醇酮、连翘甙等。然后，我们证明 QQXD 改善了流感小鼠的生存结果、抑制流感病毒复制、抑制细胞因子风暴并保护免受肺损伤。这些机制可能与改善肠道菌群失调、增加肠道碳水化合物代谢和上调氰基氨基酸代谢途径有关。据我们所知，这是首次阐明QQXD对流感病毒性肺炎的保护作用和机制的报道。
流感病毒吸附在鼻腔或口腔黏膜表面，进入人体。在 48 小时内，新复制的流感病毒达到峰值。流感相关症状在感染后 1-4 天开始出现。对于大多数感染者，流感急性症状会持续 7-10 天。炎症反应与流感病毒的复制和流感症状的出现同时发生。流感病毒感染可分为三个阶段：先天免疫阶段、自身免疫阶段和晚期病毒清除阶段，包括组织再生和修复。流感病毒感染上皮细胞后，内皮细胞和肺泡巨噬细胞产生第一波炎症因子，然后激活适应性免疫细胞分泌第二波细胞因子，促进病毒清除。如果细胞因子中的促炎因子产生过多，那么促炎反应就会明显增加，而抗炎反应就会受到控制，从而形成细胞因子风暴，这也是导致病死率增加的原因之一。因此，流感治疗在感染的早期阶段很重要，能有效减少流感病毒的复制，避免大量炎症因子释放引起的肺损伤加重。
中药已被广泛研究用于治疗流感，无论是作为单体还是作为中药化合物的制剂。一项研究发现，中药化合物可以抑制流感病毒复制和炎症细胞因子。有研究通过比较抗病毒药物筛选具有神经氨酸酶抑制作用的中药，发现黄连、板蓝根、金银花、黄芩、香叶、鱼腥草、栀子、菊花具有较强的抗病毒作用。我们发现QQXD的成分中含有甘草素、黄芩苷、汉黄芩苷、桔梗素D、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素、烯醇酮、连翘甙等。有研究发现黄芩苷在体内外对病毒有抑制作用，对炎症反应有抑制作用。先前的一项研究表明，p连翘甙可以提高甲型流感小鼠的存活率，并降低肺指数和肺病毒滴度。一项研究发现，甘草酸可以提高感染 H1N1 的小鼠的存活率，降低肺组织中的病毒滴度，并降低 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表达。在本研究中，我们发现QQXD对治疗流感病毒性肺炎有效。
我们发现QQXD改善了流感小鼠的生存状态。对照组的老鼠精神状态良好，毛色有光泽，活动正常，食物和水的摄入量没有变化，体重自然增加。感染3天后，小鼠流感感染症状明显。模型中的小鼠有典型的流感症状，包括毛发松散无光泽、毛躁、活动减少、食物和水的摄入量减少、抽搐和呼吸困难。 QQXD 中的小鼠毛发更光滑，活动减少，食物和水的摄入量减少，并且比模型组中的小鼠更轻。小鼠的流感病毒感染导致体重减轻，而用QQXD治疗的小鼠体重减轻较少。我们使用半致死剂量的流感病毒制作流感病毒肺炎模型，第8天观察到50%的死亡率。我们发现QQXD提高了流感小鼠的存活率。这与之前对有效中药成分（如黄芩苷）的研究结果一致。 QQXD 在流感肺炎小鼠中的早期应用已被证明可有效抑制病毒复制并达到治疗目的。流感病毒性肺炎导致炎症因子分泌过多，进一步加重肺组织损伤。流感病毒性肺炎肺组织重量明显增加，QQXD可降低肺病毒载量和肺指数。流感病毒性肺炎导致炎症因子分泌过多，进一步加重肺组织损伤。 QQXD可降低流感小鼠IL-1α、IL-4、IL12(P70)、TNF-α等炎症因子的表达，防止过度炎症反应加重肺损伤。
对于病毒感染，益生菌可能会作为“抗病毒药物”帮助宿主。流感病毒主要吸附在呼吸道上皮细胞上，并通过呼吸道在下呼吸道复制，似乎与肠道菌群没有明显的联系。然而，有证据表明胃肠道和呼吸系统以及它们各自的微生物群是相互联系和影响的，这被称为肠-肺轴。研究发现，益生菌可以降低对流感感染的易感性，减少肺部炎症细胞的浸润，提高病毒清除速度。相反，使用抗生素后肠道菌群的紊乱会导致感染流感病毒的小鼠的辅助性T细胞紊乱。对于小鼠流感感染引起的肠道菌群变化，葛根芩连汤有助于恢复肠道菌群平衡。我们在本研究中发现，当流感病毒感染小鼠时，QQXD中的有益菌如Lactobacillus明显减少，Oscllospira增加，Bacteroides增加。 Alpha多样性分析显示对照组和QQXD之间以及模型组之间的群落丰度没有显着差异。 Beta多样性分析揭示了三组之间微生物群落的显着差异。感染流感病毒的小鼠肠道微生物紊乱，微生物群落明显增多，与正常小鼠不同。条件致病菌如Burkholderia, Delftia, Prevotella和 Butyricoccus在模型中有所增加。人们已发现Prevotella与人类感染有关，例如艾滋病患者中其丰度增加，Prevotella可能与多种炎症性疾病有关并可能促进炎症反应。我们发现QQXD和Model之间的肠道菌群存在差异。不同菌群的富集分析显示它们在人类传染病中显着富集，这表明QQXD可能能够治疗流感等传染病。与模型组相比，QQXD 上调氰基氨基酸代谢和光合作用天线蛋白，这可能是QQXD调节肠道菌群以达到治疗效果的潜在机制。我们发现流感病毒感染增加了小鼠肠道菌群的丰度和组成，可能是致病菌的增加所致，而QQXD对流感感染小鼠的肠道菌群具有一定的调节和保护作用。
多项研究发现，流感病毒感染会影响人体的代谢。脂肪酸代谢可能在 H7N9 感染期间受到抑制，其水平可预测 H7N9 病毒感染后的致命结果。研究者还在小鼠的血清、肺组织和细支气管中捕获了 100 多种差异代谢物，包括嘌呤、嘧啶、酰基肉碱、脂肪酸、氨基酸、糖皮质激素、鞘脂和磷脂。这些代谢物中有许多属于肺表面活性物质，表明流感病毒感染引起的肺表面活性物质系统异常可能在呼吸衰竭和修复的病因学中起重要作用。另一项研究发现，感染流感的不同细胞株的脂肪酸生物合成和胆固醇代谢的分化不同。在流感感染期间，宿主体内 SCFAs 的代谢减少，SCFAs 是由结肠膳食纤维的细菌发酵产生的，在生理条件下其在肠腔内的浓度很高。有研究进一步发现，激活短链脂肪酸受体 FFAR2 可以防止细菌双重感染。根据研究结果，SCFAs 可能是治疗感染的新选择。中药可通过增加 SCFAs 水平、调节胆汁酸代谢、减少三甲胺 N-氧化物的产生、减轻炎症因子的释放和改变支链氨基酸的生物合成来有效改善脂质代谢。我们发现流感感染后小鼠肠道代谢发生变化，短链脂肪酸代谢明显减少，有机酸和脂肪酸代谢相对增加，这可能与肠道菌群的差异性变化有关。本研究结果与以往研究结果一致，即流感感染导致短链脂肪酸减少，但QQXD不促进短链脂肪酸代谢，可能无法通过这种机制治疗流感病毒感染。本研究在QQXD和模型组之间发现了不同的代谢物，并分析了代谢途径，包括氨酰tRNA生物合成、氮代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成。
肠道差异菌群的富集分析显示QQXD上调氰基氨基酸代谢。主要肠道差异代谢物为吲哚-3-羧酸、吲哚-3-甲醛、isoalloLCA、减少的4-羟基苯甲酸、3-羟基苯乙酸、天冬氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、n-乙酰色氨酸，富集分析通过以氮为主代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成控制。通过对不同菌群和代谢物的分析，我们发现QQXD可以通过调节Paracteroids, Pediococcus,和Clostridium的菌群来影响流感小鼠的代谢。主要代谢途径是氰基氨基酸代谢，这可能是QXD治疗流感的潜在机制。
该研究是对 QQXD 是否可以抑制流感病毒的初步研究，但我们尚不清楚它是否会影响血凝素或神经氨酸酶。本研究需要进一步细化流感诱导的炎症反应与肠道菌群变化之间的关系。 QQXD 已用于临床实践，但尚未进行多中心随机对照试验。
综上所述，QQXD通过抑制病毒复制、抑制炎症因子风暴、保护肺组织免受损伤等作用，可以有效治疗流感病毒性肺炎。 QQXD 对流感病毒性肺炎的作用机制可能与改善肠道微生物群失调、增加肠道碳水化合物代谢和上调氰基氨基酸代谢途径有关。本研究为流感病毒肺炎的临床应用提供了对 QQXD 的新认识。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2022.1032127/full
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