在微量血液中迅速准确检测小分子代谢物能提高众多疾病的诊断和治疗。但大部分小分子代谢物尚无小型化检测方法，导致很多医学需求仍无法得到满足。该瓶颈的主要原因在于，传统仪器的小型化思路多侧重机械层面的缩小，却仍然依赖大型仪器中使用的分子检测原理。长久以来，学术界都有一种愿景：把大型的血液检测仪器小型化、分子化，最终实现“芯片上的实验室”。要实现该愿景，不仅需要在机械层面缩小仪器，还需要开发更有效、更灵敏、更精确的分子技术。
近日，络绎科学邀请了中国科学院深圳先进技术研究院研究员於邱黎阳博士，就“蛋白医学工程：生物发光探针的代谢监测与药物筛选研究”进行了分享， 探讨了通过蛋白质理性设计和高通量筛选开发新型生物分子检测技术和设备，以突破临床和药物研发瓶颈的研究历程。
於邱黎阳
於邱黎阳本科毕业于武汉大学化学基地班，在瑞士洛桑联邦理工大学化学系取得博士学位。曾以第一作者在 Science 和 Nature Metabolism 发文，其成果受到包括美国科学促进会、EurekAlert、德国马克斯普朗克科学促进协会年报等学术媒体的报道。其课题组专注于蛋白工程，通过设计蛋白器件和工具，赋能生物医药及合成生物学应用。
如何多快好省地检测血液中的低浓度小分子代谢物？
“我们利用蛋白质工程，实现了不同场景的便携式检测。比如代谢疾病生物标志物的家庭检测、NAD 的便携式指尖血检测、免疫抑制剂等药物的血药浓度监测、血浆中关键代谢酶活性的便携式检测等等。最终，我们通过具有广泛应用场景的全遗传编码探针实现了细胞 NAD 活细胞代谢的动态成像，也为后续的药物筛选提供了工具。”於邱黎阳介绍，这是他们利用生物发光探针实现的一系列应用。
高亲和力、低成本的蛋白质生物发光探针
“芯片上的实验室”中空间狭小，成分复杂，传统的检测原理很难在该环境中实现准确定量。於邱黎阳尝试以“从小到大”的思路进行设计，在蛋白的分子层面创新检测方法，以利用简单的小型化设备完成复杂微量样品的检测。
以苯丙酮尿症这种基因疾病为例，每个人出生后都会筛查是否携带苯丙酮尿症相关基因。正常人的血浆苯丙氨酸浓度值约为 80μmol，若不幸罹患该病症，患儿则无法正常代谢血液中的苯丙氨酸，其血浆浓度可达 1200μmol 以上，并导致脑部发育迟缓。因此患者发育期需要始终保持低蛋白饮食。
婴儿时期，家长通常只能通过经验评估蛋白摄入量、调整饮食。目前血液苯丙氨酸的检测方法是从婴儿足跟取血，制成干血斑，并将样品寄到中心实验室检测。家长通常两三天后才会得到结果，十分不便；若导致临床管理不到位，患儿则面临脑部发育迟缓的风险。
“有没有办法通过蛋白质探针检测苯丙氨酸？甚至将此方法扩展到更广泛的其它血液小分子代谢物的检测中呢？”苯丙氨酸在苯丙氨酸脱氢酶的催化下，转化成苯丙酮，同时生成一分子的 NADPH，於邱黎阳受此启发，希望开发一个很精准的探针来检测所生成的 NADPH。
以上反应是 1:1 高度定量的，所以通过定量 NADPH 就可以倒推苯丙氨酸的浓度。其实，这也是现行苯丙氨酸临床检测使用的传统酶促法。但是，临床上并没有比较简便的方法检测 NADPH，特别是缺少在患者的家里就能实现的检测。
“要检测 NADPH 这种辅酶，也许可以先找到一个配体和一个受体蛋白。它们之间的亲和力靠 NADPH 的浓度调控。没有 NADPH，配体与受体蛋白便不会结合。”於邱黎阳如此想到，“随后在配体旁边加荧光团，如常见的 Cy3。然后，配体和荧光团通过自标记蛋白 SNAP 被标记到受体蛋白和生物发光蛋白 NanoLuc 上，串联形成一个有功能的探针整体。”
来源：於邱黎阳提供
没有辅酶的时候，上述探针分子处于打开的状态，生物发光蛋白表现出蓝光。有辅酶的时候，结合力变高，出现生物发光的能量共振转移的现象，探针发出红光。
该设计理论上可行，然而，为了让探针具有足够的信号变化却并不容易，还需放大辅酶调控受体和配体之间亲和力的能力。
於邱黎阳的做法是，在受体蛋白引入不稳定性。通过蛋白质一级序列的循环排列，在蛋白质 N 端和 C 端通过多个氨基酸残基链接，然后把受体蛋白配体结合位点附近的氨基酸残基人为切开，形成重排的 cpDHFR 受体蛋白。“如此，辅酶对亲和力的调控增加到 150 倍，这样制成的探针响应虽有提高，但仍不理想。”
后续，他们更加剧烈地引入了蛋白结构的不稳定性，并希望辅酶的存在可以重塑这种不稳定性、并增加受体蛋白和配体之间的相互作用。
“我们最激进的设计方法，就是把 DHFR 受体蛋白切开，插入外源性生物发光蛋白。为了该生物发光蛋白插入的方便，也对其做了重排。将生物发光蛋白的 N 端和 C 端以 linker 连接，随后将其较柔韧的一个结构域剪开并嵌入 DHFR。新的融合蛋白实现了辅酶诱发的高达 1400 倍的亲和力变化，构造了响应极高的探针。” 该探针响应的倍数变化为 30 倍左右，是发表时所认为响应最大的探针之一。
来源：於邱黎阳提供
在不同 NADPH 浓度下，探针发射的光谱从蓝到红，变化清晰，用较简单的感光探头，如手机相机或普通数码相机等，就可完成检测。通过分析红蓝像素比，便可确定 NADPH 浓度。于是，於邱黎阳团队根据该探针构建了苯丙酮尿症血液检测试纸。使用该试纸，采集 0.5 微升指尖血即可完成检测。通过随后的临床实验证明，试纸与质谱高效液相色谱检测的浓度高度一致。
来源：於邱黎阳提供
“除了对辅酶进行检测，能否针对任意小分子进行探针设计？”并非所有待测物都有现成的受体蛋白，于是他们通过免疫动物的方法开发了待测物的特异性单克隆抗体，并将抗体的抗原结合片段作为探针中的受体蛋白。据此，於邱黎阳团队设计了甲胺蝶呤、茶碱、奎宁三种药物的生物发光探针。之所以选择这三种物质，是因其血药浓度适应范围非常窄，过低无效果，过高则产生毒性。
全遗传编码探针，实现活细胞检测与成像
於邱黎阳指出，该类技术的成功案例不仅限于血液检测的小型化。团队开发的蛋白质探针是全遗传编码的，这为在活细胞内检测各类代谢物提供了可能。“只要把蛋白质探针的质粒转染到待测细胞中，就可以在活细胞中实现不同区室中代谢产物的实时检测。而细胞不同区室中关键代谢物的动态变化在诸多疾病的进展过程中都扮演着非常重要的角色。”
据此，该团队研发了全遗传编码的 NAD 蛋白探针。
於邱黎阳解释到，瞄准 NAD 代谢监控这一应用，是因为越来越多的研究证明 NAD 和衰老之间有非常密切的联系。机体 NAD 浓度伴随着衰老或衰老相关疾病的出现而下降，学术界和工业界也因此在不断研发高效干预 NAD 代谢的策略，以实现衰老的管理甚至逆转。
然而，由于缺少简便的 NAD 检测方法，精准的衰老管理较难实现。於邱黎阳以一家美国公司为例，该公司检测一次 NAD 的费用为 248 美元。”高昂的费用难以支撑个性化的 NAD 管理，且流程耗时。
利用生物发光探针的原理，该团队针对 NAD 设计了一套比较廉价又便携的检测设备。该探针已用于二期临床试验，并已成功评估了一些膳食补充剂的药效；可以预料，未来它也将有助于衰老干预技术和 NAD 干预策略的定量评估。
这种全遗传编码生物发光探针的另一大优势是可以通过大肠杆菌实现批量生产。“有机荧光团的客制化合成非常昂贵，几毫克的成本高达十几万人民币。而全遗传编码探针避免了有机荧光团的合成，将成本大幅降低。”
最后，於邱黎阳分享了基于全遗传编码 NAD 探针的代谢研究。
全遗传编码的探针不仅可以作为体外诊断工具，也可窥测细胞内不同细胞器的 NAD 代谢，从而为开发新的 NAD 代谢调控药物提供工具。
NAD 代谢调控是很多退行性疾病行之有效的潜在疗法，很多国际药企正在针对该途径开发各种新药物，但行业仍缺少能清晰反应不同细胞器 NAD 代谢变化的工具，难以全面评估 NAD 在细胞中的时空分布。而 NAD 探针的发明，可以在活细胞中实现不同区室中 NAD 代谢的实时检测，解决高通量药物筛选的诸多问题。於邱黎阳表示，该团队已筛选了将近 2000 种药物分子，在不同门类的药物分子中发现了非常有效的 NAD 代谢调控物质。
“除了高通量筛选，该探针还可以进行活细胞成像。”生物发光探针可以在显微镜下工作，以便观测到在药物作用下各个细胞过程中 NAD 代谢的动态变化，有助于揭示 NAD 转运机制等尚不明确的重要科学问题。
当然，蛋白生物发光探针也有局限性，并非一个放之四海而皆准的万能方法。比如对于有企业提出的降钙素原检测探针的定制需求，於邱黎阳表示至少目前没有现成的探针可以满足需求，“虽然原理上可行，但打磨出性能优异的相关探针还需要一段时间。”
转自：“生物世界”微信公众号
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