农生智慧 | 陆钰明课题组开发病毒代理筛选系统实现水稻基因高效敲除和敲入

近日，上海交通大学陆钰明课题组和朱健康院士团队合作在Journal of Integrative Plant Biology发表了题为“High-throughput genome editing in rice with a virus-based surrogate system”的研究论文（https‍://doi.org/10.1111/jipb.1‍3381）。该研究通过双生病毒高效递送并表达sgRNA，结合稳定表达Cas9和潮霉素代理筛选系统的水稻受体材料，建立了一套水稻高通量基因敲除和敲入系统。

近年来，随着基因编辑技术在植物育种研究中的广泛应用，越来越多的研究聚焦于利用基因编辑技术对目的基因的启动子或结构域进行饱和突变，创制遗传多样性。然而，由于传统的基于T-DNA的植物遗传转化工作量巨大，编辑效率偏低，使得规模化饱和突变成本较高，难以广泛应用。

该研究利用WDV病毒可以自我复制并高效表达的特性，在一个高表达Cas9及潮霉素代理筛选系统的水稻背景材料中，利用WDV高效递送并表达两个sgRNA，其中一个sgRNA靶向潮霉素代理筛选系统，高效修复失活的潮霉素基因（HygM），用于筛选瞬时编辑事件；另一个sgRNA靶向目的基因，从而实现高效编辑，该系统被命名为WDV-Gate03。相对于传统的T-DNA系统，WDV-Gate03系统无需T-DNA整合即可实现高效组培筛选，大幅提升了幼苗再生数量；同时，利用WDV-Gate系统高效表达sgRNA的特点，其基因编辑效率（66.8% vs. 90.1%）以及纯合编辑（含双等位突变，36.3% vs. 70.7%）的效率也得到了大幅提升，这一结果显示了WDV-Gate系统应用于高通量基因编辑的可行性。

随后，研究团队设计了42个靶点靶向SLR1基因的DELLA结构域，以对其进行饱和突变。鉴定结果显示，SLR1突变体库的编辑效率高达94.4%，并产生了多个不同株高的等位突变类型。进一步分析发现，其中大多数再生植株（68.9%）不含T-DNA，显示了该系统在水稻高通量编辑上的特有优势。此前，该研究团队利用化学修饰的供体DNA，实现了水稻基因组高效的片段靶向敲入和替换。在该项研究中，作者将化学修饰的供体DNA与WDV-Gate03系统相结合，在AGO4，MDH2，TOR基因的N端精准融合了3xFlag标签，标签原位融合效率最高达13%，且可稳定遗传给后代。这一结果进一步显示了该系统在片段敲入上的应用潜力。

转自：“iPlants”微信公众号

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