结构生物学：我们用一百年改变了什么？

在近代生物学发展史上，有一个问题逐渐占据了科学家的视野：蛋白质、核酸、多糖……这些构成生命活动基础的大分子的微观结构是什么样的？解决这个问题满足的不仅仅是科学家们的好奇心，更重要的是对结构的认知将极大地帮助人类在分子层面理解复杂的生命活动，并据此设计出阻止或加强其作用的药物，特别是基于蛋白质结构的药物研发。

我们现在知道目前解析生物大分子结构的主流实验手段是X射线晶体学和冷冻电镜，而AI又与这两种手段相辅相成。但在生物学发展早期，我们只能推测大分子的成分，窥见它们精巧而严密的运作机制，但对它们的结构细节一无所知，而结构的未知又影响了人类理解它们的功能。

诺贝尔奖获得者费曼曾经半开玩笑地说：“许多基础的生物问题是非常容易解决的：只要能看到它们就行！"

然而观测这些微小的分子以及它们那更加微小和复杂的空间结构谈何容易，实际上，这个问题直到今天也不能称得上完全解决。但几十年来，科学家们为此付出了巨大的努力并取得了可观的成果，并最终形成了结构生物学。这是一个漫长而艰难的故事，但也不乏有趣之处。

1895年，威廉·伦琴发现了X射线。

这种具有穿透性的电磁波是19世纪最重要的物理学发现之一，对许多领域和学科都产生了深远的影响，不过这不是本文要讨论的重点，我们直接来看X射线是如何影响甚至可以说奠定了近代结构生物学的发展的。简单来说，人们发现极细的X射线流在穿过化合物晶体后，会在照相板呈现出一些具有规律的衍射图案，这些衍射图案是否有可能反映出了晶体的原子排列规律呢？

经过几十年的探索，科学家们终于找到了通过数学规则，利用X射线衍射图案来推算晶体中原子排列的方法。这一技术，使得制备晶体→X射线衍射→推算结构的解析大分子结构的方式成为可能，X射线晶体学的时代开启了。

X射线解析蛋白质结构的首例突破是在1960年。约翰·与他的同事马克斯·佩鲁兹””解析了第一个蛋白质——抹香鲸肌红蛋白的三维结构。与今天科学家们能解析的蛋白结构相比，肌红蛋白的结构较为简单，仅由8条α螺旋组成，且没有4级结构。但在当时，所有人都知道，一个新的时代开启了。

蛋白质的折叠方式与空间构象对于蛋白质的功能有着决定性的作用。掌握了蛋白的三维结构，就掌握了开启和关闭蛋白功能的钥匙。在接下来的几十年里，一个又一个重要的蛋白质结构被解析出来，核糖体、肌动蛋白、ATP酶、氧化还原酶、RNA聚合酶……

结构生物学的黄金时期一直持续到本世纪，以至于2006年诺贝尔化学奖获得者罗杰·科恩伯格后来说“2007年至2019年，当我为Nature杂志工作时，我们经常对结构生物学论文的数量开玩笑：似乎每周都有一个新的、重要的蛋白质结构发表。”

X射线晶体学并非完美，它的缺陷在这个过程中暴露出来。首先，想要获得一个相对完整的模型，就要获得分辨率足够高的能够得到清晰的X射线“照片”的蛋白晶体，另外，一次X射线穿透获得的是晶体某一角度的衍射图案，这对于计算蛋白质三维结构是远远不够的，需要多角度的几百张甚至成千上万张照片才能构建出一个蛋白质三维结构的雏形，并通过建模和修正得到最终的成品“模型”。这期间的工作量特别是数学部分无疑是巨大的，即使有计算机和更好的X射线设备的辅助计算，X射线晶体学仍然很耗时。还有一个问题是，一些类型的蛋白质被证明很难或不可能结晶，如何进行对于此类蛋白三维结构的探索呢？

与传统的常温电镜不同，冷冻电镜通过将样品冷冻在一层非晶体的玻璃态冰膜中然后在低温下用电镜成像观察，从而得到结构。这个方法无疑不再对蛋白晶体有硬性要求，可以最大可能的观察到生物大分子的自然状态下。并且，由于样品制备时使用了瞬时冷冻的技术，与X射线晶体衍射学相比，冷冻电镜技术可以瞬时的捕捉到同个样品在不同状态下的近生理构象。不过，虽然这项技术发明得很早，但起初只能对于病毒等较大或具有高度对称性的结构进行解析。因为电镜用于轰击样品的电子具有高能量，无论是生物样品本身还是仪器都难以承受长时间的轰击，而有限次数的曝光得到的图像偏差过大，难以用于精细的结构生物学领域。为了降低电子对样品的损伤，冷冻电镜在低温下，采用了低剂量的图像采集方案，增强图像的信噪比。而近年来，直接电子检测相机的研发和飞速发展的图像处理算法的应用，使得冷冻电镜的分辨率得到了飞跃式的提升，这次分辨率的极大提升，被称为“第一次分辨率革命”。另一方面，随着电镜本身的技术发展，目前已经可以利用冷冻电镜技术观察到原子分辨率的信息，在300 kV冷冻电镜的帮助下，水分子的氢氧原子清晰可见，这就是近年来震撼了冷冻电镜学界的“第二次分辨率革命”。另外，200 kV的冷冻电镜也已经以高分辨解析、多功能用途而广泛安装使用。

近年来，冷冻电镜逐渐成为了生物大分子解析的主流手段之一，但是一台冷冻电镜高昂的价格令许多科研工作者或药企研发人员望而却步。而为了使更多的科研工作者能在分辨率革命中受利，在诺贝尔化学奖得主Richard Henderson的呼吁和推动之下，更为“接地气”的100 kV冷冻电镜也被研发出来。100 kV的电镜打破了对于高电压的需求，在电镜整体设计上和相机选择上都以最高性价比的方案进行整合，相比之下较低的价格，使得100 kV的冷冻电镜成为了一台人人都有机会使用的冷冻电镜。

我们在文章最初说过，研究蛋白质和其他大分子的结构是为了了解其功能，并最终转化为改善人类健康和生命质量的应用成果。为了这个目标，科学家们利用X-射线晶体学和冷冻电镜技术解析了一个又一个蛋白的结构，而在无数量变的积累背后，是否有一项科学家们追求的质变存在呢？

1965年，《生物化学年鉴》说"人们甚至希望有一天可以完全从氨基酸序列中推断出构象。"

1972年，克里斯蒂安·安芬森在诺贝尔奖演讲中说："我们对序列和三维结构之间相关性的大量数据积累，加上多肽链折叠的能量学理论的日益成熟，预测蛋白质构象的想法越来越现实了。"

利用氨基酸序列直接预测蛋白空间构象是结构生物学家和分子生物学家们很早就有的渴望。虽然在过去的几十年中，科学家们一直致力于在实验室中用X射线或者冷冻电镜解析蛋白质结构，但科学家们并不会把“将一切存在的蛋白质用X-射线或者电子束打一遍”作为最终目标，掌握规律才是人类在科学探索中真正想要追求的东西。

而AI的发展引出了这一目标成为现实的可能。经过深度学习的算法已经可以做到通过与已知结构的蛋白序列进行比较来预测目的蛋白的结构。尽管要真正解析未知蛋白的结构还言之过早，但诸如AlphaFold2等软件也的确为结构生物学的研究带来了不少便利。通过AlphaFold2等计算模拟的方法，与以冷冻电镜为代表的实验结构生物学相结合，两者相辅相成，为生物大分子结构解析，特别是药物发现领域带来了巨大的助力。

随着结构生物学的发展，人们对药物靶标蛋白的结构和功能的关系的了解越来越深入，逐渐形成了基于结构的药物设计策略，Structure Based Drug Design (SBDD)。

1995年，罗氏基于SBDD开发了蛋白酶抑制剂Saquinavir，其抗逆转录病毒的功效可以配合其他药物治疗艾滋病。也使得基于结构的药物设计策略的潜力得到证实。之后，各类抗病毒、抗肿瘤、炎症等新药研发成功。时至今日，对靶标结构的认知和功能的预测几乎成为创新药开发中绕不过去的一环，以近年大热的难成药靶点KRAS为例，安进公司通过KRAS G12C突变体的GTP结合位点“口袋”研发出了首款抑制剂，而这只是结构生物学在药物开发中发挥基础作用的无数案例的一个。有越来越多的例子证明，结构中一些亚纳米级别的微小细节变化，为最终的药物成功与否带来了决定性的影响。

相信在未来，技术的发展将带人类进一步认知生命活动中那微小而浩瀚，精密且复杂的分子世界，并为药物研发和疾病攻克带来更多启发和帮助。