研究人员在人类基因组中的每个表达基因上使用了扰动序列工具，将每个基因与其在细胞中的工作联系起来。
人类基因组计划是一项雄心勃勃的计划，对每一个人类DNA片段进行测序。该项目吸引了来自世界各地研究机构的合作者，包括麻省理工学院的怀特黑德生物医学研究所，最终于2003年完成。现在，20多年过去了，世界著名的分子药学和遗传学家、CRISPR技术先驱Jonathan Weissman和他的同事们已经超越了这个序列，展示了第一个在人类细胞中表达的基因的全面功能图谱。新项目的数据发表在6月9日的《Cell》杂志上，将每个基因与其在细胞中的工作联系起来，这是多年来在单细胞测序方法Perturb-seq上合作的成果。
这些数据可供其他科学家使用。Weissman说:“这是一个巨大的资源，就像人类基因组是一个巨大的资源一样，因为你可以进入并进行基于发现的研究。”他也是怀特黑德研究所的成员和霍华德·休斯医学研究所的研究员。“你不需要提前定义你将要研究的生物学，你有这个基因型-表现型关系的地图，你可以进入并筛选数据库，而无需做任何实验。”
该筛选使研究人员能够深入研究各种各样的生物学问题。他们用它来探索具有未知功能的基因对细胞的影响，研究线粒体对压力的反应，并筛选导致染色体丢失或增加的基因，这种表型在过去被证明很难研究。“我认为这个数据集将使来自生物学其他领域的人甚至还没有想到的各种分析成为可能，突然之间他们就可以利用这个数据了，”Weissman实验室前博士后Tom Norman说，他是该论文的高级合著者之一。
Perturb-seq
该项目利用Perturb-seq方法，使其能够以前所未有的深度跟踪基因打开或关闭的影响。2016年，包括Weissman和麻省理工学院教授Aviv Regev在内的一组研究人员首次发表了这种方法，但只能用于小组基因，而且花费巨大。
Weissman实验室的博士生Joseph Replogle的基础工作使大规模的Perturb-seq图谱成为可能，他也是本论文的第一作者之一。Replogle与普林斯顿大学分子生物系助理教授Britt Adamson以及10x Genomics公司的一个团队，开始创建一个可以放大的新版本的Perturb-seq。研究人员于2020年在《自然-生物技术》杂志上发表了一篇概念证明论文。
Perturb-seq方法使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术将基因变化引入细胞，然后使用单细胞RNA测序技术捕获特定基因变化导致表达的RNA信息。因为RNA控制细胞行为的所有方面，这种方法可以帮助解码基因变化对细胞的许多影响。
自从他们最初的概念证明论文以来，Weissman、Regev和其他人已经在较小的尺度上使用了这种测序方法。例如，研究人员在2021年使用Perturb-seq来探索人类和病毒基因在HCMV(一种常见的疱疹病毒)感染过程中如何相互作用。
在这项新研究中，Replogle和合作者包括Weissman实验室的研究生、论文的共同第一作者Reuben Saunders，将该方法扩大到整个基因组。利用人类血液癌症细胞系以及来自视网膜的非癌细胞，他对超过250万个细胞进行了Perturb-seq，并利用这些数据建立了一个将基因型与表型联系起来的全面地图。
深入研究数据
在完成筛选后，研究人员决定使用他们的新数据集，并检查一些生物学问题。“Perturb-seq的优势在于它可以让你以一种不带偏见的方式获得一个大数据集，”Norman说。“没有人完全知道你能从这种数据集中得到什么限制。现在的问题是，你到底用它做什么?”
第一个，也是最明显的应用是研究功能未知的基因。由于该筛选还读出了许多已知基因的表型，研究人员可以使用这些数据来比较未知基因和已知基因，并寻找相似的转录结果，这可能表明基因产物作为一个更大的复合体的一部分一起工作。
其中一个名为C7orf26的基因突变尤为突出。研究人员注意到，移除导致类似表型的基因是一种名为整合器的蛋白质复合体的一部分，它在制造小型核RNA中发挥了作用。Integrator复合体由许多更小的亚基组成——先前的研究表明有14种单独的蛋白质——研究人员能够确认C7orf26构成了复合体的第15种成分。
他们还发现，15个亚单元在较小的模块中一起工作，在Integrator复合体中执行特定的功能。Saunders说:“如果没有从几千英尺高的角度观察情况，就不太清楚这些不同的模块在功能上是如此不同。”
Perturb-seq的另一个好处是，由于该检测聚焦于单细胞，研究人员可以利用这些数据来观察更复杂的表型，这些表型在与其他细胞的数据一起研究时变得混乱。Weissman说:“我们经常把‘X基因’被敲除的所有细胞取平均值，看看它们是如何变化的。但有时，当你敲除一个基因时，失去同一基因的不同细胞的行为不同，而这种行为可能被平均忽略。”
研究人员发现，一个基因子集的移除会导致不同细胞产生不同的结果，这与染色体分离有关。它们的移除会导致细胞失去一条染色体或增加一条额外的染色体，这种情况被称为非整倍体。Weissman说:“你无法预测失去这个基因的转录反应是什么，因为它取决于你获得或失去的染色体的次级效应。我们意识到，我们可以扭转这一局面，创建这种复合表型，寻找染色体的获得和丢失的签名。通过这种方式，我们对正确分离DNA所需的因素进行了首次全基因组筛选。”
Norman说:“我认为非整倍体研究是迄今为止对这些数据最有趣的应用。它捕捉了一种只能通过单细胞读出的表型。你不能用其他任何方式去追求它。”
研究人员还利用他们的数据集研究了线粒体对压力的反应。线粒体从自由生活的细菌进化而来，它们的基因组中携带着13个基因。在细胞核DNA中，大约有1000个基因与线粒体功能有关。“长期以来，人们一直对核DNA和线粒体DNA在不同的细胞条件下如何协调和调节很感兴趣，尤其是当细胞受到压力时，”Replogle说。
研究人员发现，当他们干扰不同的线粒体相关基因时，核基因组对许多不同的基因变化的反应是相似的。然而，线粒体基因组反应的变化要大得多。
“为什么线粒体仍然有自己的DNA，这仍然是一个悬而未决的问题，”Replogle说。“从我们的工作中得到的一个大的结论是，拥有一个单独的线粒体基因组的一个好处可能是在应对不同的压力源时拥有本地化或非常具体的基因调节。”
Weissman说:“如果一个线粒体破裂，而另一个线粒体以不同的方式破裂，那么这些线粒体可能会做出不同的反应。”
在未来，研究人员希望将Perturb-seq用于他们开始研究的癌细胞系之外的不同类型的细胞。他们还希望继续探索他们的基因功能图谱，并希望其他人也能这样做。诺曼说:“这真的是作者和其他合作者多年工作的成果，我很高兴看到它继续成功和扩大。”
参考文献
Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq
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