近年来，基因疗法的市场愈发火热，已经迈入快速增长的黄金时代。随着递送系统在基因疗法中的应用的逐渐成熟，基因治疗药物转化的壁垒被逐渐打破，多款产品展现出巨大潜力。目前，国内基因治疗药物的申报势头正猛，已有几十款药物进入临床，逐步进入规模化生产中。
面对如此逐步庞大的市场，基因治疗领域中最常用的载体AAV和慢病毒的生产都需要质粒作为重要的制药原材料，因此每年需要大量符合质量要求的质粒来满足基因治疗领域中的市场需求，由此可见质粒在工艺生产的市场中需求强劲。面对日益增长的产能需求，国内企业纷纷扩大产能，但基于市场大小和发展历史的不同，眼下与国外的整体生产工艺水平存在差距。若想在该领域内实现弯道超车，要不断取其精华，不断总结宝贵的经验，以此加速国内质粒的生产发展。
质粒的构型
质粒广泛存在于生物界，是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体意外的遗传物质，具有自主复制能力的，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，可用目的治疗性基因替换非必需遗传物质，把有用的外源基因送进受体细胞中，并进行增殖和表达。由于质粒分子量小，稳定易于操作，安全可靠，容易纯化分离，因此是基因工程中最常用、最简单的载体。
当下，除了酵母的杀伤质粒是RNA质粒外，其他都是DNA质粒。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
为了更好地适应细胞的生理特点，DNA质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中。目前，标准环形双链的DNA质粒分子具有三种不同的构型，分别为超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA以及线性质粒DNA分子。
DNA质粒作为在基因疗法的工艺生产中的原始材料，其最终目的是将质粒所携带的目的基因导入靶细胞并表达，进而达到治疗或预防疾病的目的，因此高质量的质粒是确保裸质粒等基因载体安全性和有效性的前提。而在这三种质粒中，超螺旋构型的质粒在细胞中的转染和表达效率最高，也是当下工艺生产中的主流。
质粒在生产工艺中面临的挑战
在当前的生产工艺中，质粒通常在大肠杆菌中发酵生产。质粒作为胞内生物大分子，在工艺生产中面临诸多挑战。目前，行业中质粒生产规模基本在5-300L之间，产率0.3g/L左右，超螺旋比例90%左右，并且细胞在裂解后，质粒占比仅3%左右。因此质粒的产率、超螺旋比例及下游超滤纯化都面临着巨大的压力。其当下面临的困境无论是对于DNA疫苗还是下游病毒生产效率与质量都形成了重大影响。
从生产流程中可以看到，大肠杆菌细胞库的建立和发酵工艺开发是生产超螺旋质粒DNA的起始步骤，在整个生产过程中起着关键作用。可以通过以下几个方面来优化当下质粒生产工艺。
首先，种子库的建立和筛选，将合格的重组质粒转化至大肠杆菌工程菌，经过克隆筛选后建立种子库系统。为了保证种子库没有外源因子污染以及目的基因序列和其他元件准确性，对种子库进行筛选鉴定，包括革兰氏染色、生化实验、抗生素抗性检测、外源噬菌体检测、质粒酶切分析等，此过程需要确保符合法规的要求，例如来源清晰、可追溯，能够开展传代稳定性和安全性研究、不使用动物源物料和抗生素等，同时也要考察质粒的产量和质量。
然后，质粒工艺开发中的发酵工艺和培养基优化。发酵主要是在培养方式、营养物质、溶氧、pH、温度、代谢产物这几个方面进行优化。培养基的优化可以在培养基成分及浓度的优化，比如碳源、氮源、碳氮比的优化、无机盐种类及浓度等方面进行优化。
大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响。
不论是菌种筛选还是工艺开发，其工作量都是巨大和复杂的，也非常耗时。传统方法主要基于摇瓶或小型发酵罐进行。但2种方法存在着客观的缺陷和瓶颈。摇瓶自动化程度低，效率低，无法动态监测发酵过程，也无法在实验过程中精确调控PH和持续补料，同时重复性差，放大失败，试剂耗材、人力成本高。而小型发酵罐的通量是致命的，同样也有重复性差，耗费人力，试剂耗材成本高的问题。
因此，摇瓶和小型发酵罐都不适合甚至无法完成这样的工作。事实上，高通量、自动化、DoE是正解，也是未来的发展趋势。
贝克曼库尔特最新收购的BioLector XT新一代高通量微型生物反应器就是这样的技术。其特别适用于微生物的菌种筛选、培养基优化、发酵条件优化等工作。可以弥补摇瓶或小型发酵罐的缺陷，帮助客户从源头提升质粒的产量和质量。
BioLector XT高通量微型生物反应器基于标准的微孔板配合非侵入式光学传感器进行操作。同时进行多达48个平行培养，工作体积800 – 2400 µL，孔间无差异，适合有氧、微氧、厌氧培养。系统除具有常规的温度、湿度、振荡功能和氧气、二氧化碳浓度调控外，还可实时在线监测生物量浓度、pH 值、溶氧值 (DO) 以及荧光蛋白或底物等发酵参数。通过微阀控制系统可灵活调控每个培养孔的 pH 以及补料策略。同时BioLector XT可与自动化工作站整合，使用便捷, 无需校准、装管。
当使用BioLector XT进行生产质粒的大肠杆菌菌种筛选时，它可以在小体积高通量下，模拟大生产条件，在线监测发酵参数，并进行PH调控和补料，同时比较48个菌株或者同一菌株在不同条件下的表现，从生物量与产物等维度同时评估不同菌株/条件的表现，帮助客户快速获得可在大规模条件下适用的真正高质量的菌株和工艺条件，提高工作效率和质量的同时解放人力，降低实验成本。革命性解决小罐的通量和摇瓶无法揭示发酵过程与灵活调控PH、补料的局限。
当使用BioLector XT进行质粒发酵工艺开发/优化时，结合自动化工作站可进行培养基的自动制备，自动接种、自动取样以及保存样品等。系统在进行数百个含生物学重复的不同组合的试验后，通过DoE计算理论上优化的实验,以确定质粒生产所用的培养基配方或工艺条件。最后再进行不同补料速率的优化和比较。最终完成发酵工艺和培养基的优化。
此外，BioLector XT高通量微型生物反应器具有很好的放大性。公开文献表明，不论是大肠杆菌还是谷氨酸棒状杆菌都可以放大到20L。针对质粒的生产，一些小规模生产，BioLector XT的工艺开发可以直接应用于生产规模。它的出现可以帮助客户加快研发进程，从源头提升质粒的产量和质量。而且结合DOE获得的大量高质量的数据可以帮助客户充分理解发酵过程，实现高质量的批次定制。
转自：博舜科研
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