威斯腾生命科学研究院 2022-05-06 16:30
E.coli 的乳糖操纵子（元）含 Z、Y 及 A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列 O、一个启动序列 P 及一个调节基因 I。I 基因编码一种阻遏蛋白，后者与 O 序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由 P 序列、O 序列和 CAP 结合位点共同构成 lac 操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac 操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在 PI启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合，阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac 操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经 b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与 O 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
材 料
1、诱导表达材料
( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基
酵母膏 (Yeast extract) 5g蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG 溶于10 mL 蒸馏水中，0.22 μm 滤膜过滤除菌，分装成 1mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol /L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2% SDS（电泳级）0.1 ％ 溴酚蓝 10％ 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解缓冲液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法
( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS0.2 ％ 溴酚蓝
20 ％ 甘油
实 验 方 案
1、外源基因的诱导表达
( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体 DNA 和目的基因。
( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒 DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。
( 4 ）如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子，则在 30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600 达 0.4-0.6 ，迅速使温度升至 42 ℃ 继续培养 3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为 tac 等，则 37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG 至终浓度为 1 mmol / L。继续培养 3 -5h 。
( 5 ）取上述培养液 1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加 100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作 SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
细菌的裂解常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。
实 验 步 骤
酶溶法。
常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
主要步骤为：① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加 3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
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