质谱技术+蛋白质组学有多强？冲击高分综述！

蛋白质的鉴定工作主要由MS/MS质谱仪负责，然后通过将质谱检测结果与数据库中的数据进行比对，最后确定出蛋白质的氨基酸序列。而蛋白质鉴定的又是重点环节，所以，成功掌握质谱检测技术，就掌握了蛋白质研究的关键。

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蛋白质组学简介

蛋白质组学：源于蛋白质（protein）和基因组（genome）两个词的组合，意指一个细胞或者一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。该术语首次出现在 1994 年意大利锡耶纳 Marc Wilkins 所做的学术报告:“2D Electrophoresis: from protein maps to genomes”中，该论文发表于1995年，是他博士课题的一部分。

01、特点

1） 同一基因组在不同细胞、不同组织中蛋白质表达各不相同

2）蛋白质组在空间和时间上呈动态变化

蛋白组学所处的位置

02、研究内容

对象：蛋白质组

范围：细胞 / 组织 / 生物体 中的蛋白质组成及其变化规律

目的：

1） 蛋白质间相互作用关系

2）揭示蛋白质功能

3）揭示细胞生命活动规律

即在整体水平上大规模研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、结构、翻译后的修饰、功能、蛋白与蛋白相互作用等。

02

质谱仪简介

质谱：带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像

质谱仪：一类能够使物质离子化并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或轨道稳定与否实现质荷比（m/z）分离，通过检查强度后实现物质分离的仪器

质谱仪构造：

进样系统 / 离子源 / 质量分析器 / 检测器 / 数据处理系统等

质谱仪原理：

1）离子化：使用电离技术将经酶切的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷；

2）离子分离：通过它们的质荷比（m/z）的差异使其得到分离并得到质量图谱；

3）分析：通过样品的质量图谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。

01、质谱仪基本原理及构成

1）进样系统

样品要求：能汽化的是固体 / 液体 / 气体样品

进样方式：

气体样品：通过调节进样速度，直接进样送入离子源

液体样品：预热挥发汽化再进入离子源

固体样品：需配备特殊装置，先将样品在减压加热的情况下汽化，然后再进入离子源

系统分类：直接进样系统 / 间接进样系统 / 分子分离器（又称载气分离器，与色谱仪联用时的特殊进样系统，其作用是将由色谱仪器流出物中的载气除去，而只让样品组分进入质谱仪器的离子源）

2）离子源

质谱仪器中的离子源是仪器的重要组成部分，与仪器的灵敏度、分辨率等主要性能指标有密切的关系。

功能作用：使被分析的物质分子 电离 成离子(正离子及少量的负离子)，并使正离子加速进入质量分析器

多数情况下，可把产生的离子聚合成一定的几何形状(矩形或圆形)和一定能量的离子束，约束离子运动轨迹

分类：电子撞击型 / 离子撞击型 / 表面电离 / 场致电离 / 激光电离 / 化学电离….

例如：ESI（ElectroSpray Ionization） / MALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization）

离子源 -> 质量分析器过程中的离子通道/离子阱

3）质量分析器

质谱仪器中的质量分析器是仪器的核心元件，包括以下几类:

Ion Trap / Time of Flight / Quadrupole / FT-ICR

其中 Ion Trap 分为:3D Ion Trap / Linear Ion Trap / Orbitrap，Orbitrap 是目前质谱蛋白质组学研究中最流行、最实用的质量分析器

4）轨道离子阱

工作原理：在磁场作用下，离子围绕中心电极的运动（径向）和沿中心电极的运动（轴向）。因为离子质量不同，在达到谐振时，不同离子的轴向往复速度是不同的。设定在离子阱中部的检测器通过检测离子通过时产生的感应电流，继而通过放大器得到一个时序信号。通过傅立叶变换(Fast Fourier Transform, FFT)，得到频谱图；而共振频率和离子质量的直接对应关系，可以由此得到质谱图

3D quadrupole ion trap 三维四极离子阱

5）三维四极离子阱

缺点：存储离子数量有限 / 低分辨能力 / 低质量的限制 （与 Linear Ion Trap  相比）

优点：灵敏度增加 / 检测所有存储的离子的m/z值 / 可以串联质谱（与 Transmission Quadrupole  相比）

6）检测器

功能：将离子微弱电流加以放大，检测记录的离子类型及相对丰度进行质谱分析。影响仪器的灵敏度

检测方法：

1. 直接电测法 - 离子流直接为金属电极所接收，然后用电学方法加以记录

2. 二次效应电测法 - 在离子流接收过程中，使离子引起二次效应，产生二次电子或光子，然后用电学方法加以记录

3. 光学法 - 利用感光板使离子在感光板上感光，或引起荧光物质发光，然后根据黑度或荧光强度来检测离子流的强度

7）真空系统

作用：

1. 离子的产生与分离，均是在高度真空状态下进行的，只有这样，才能保证样品在较低温度下汽化。

2. 离子在运动中有必需的分子自由程，同时，加速电场和倍增器的高电压以及发射电子的丝极，也必须在真空状态下才能正常工作。

结构：

旋转泵 / 扩散泵 串联组成。近来，较高级的仪器使用涡轮分子泵和溅射离子泵，它们可达到更高的真空度。

8）常用生物质谱技术

1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

matrix-assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry

简称：MALDI-TOF-MS

原理：

1.  将样品与小分子基质(肉桂酸、芥子酸及其衔生物)混合共结晶

2.  当紫外激光照射晶体时，基质吸收能量使样品与基质分子解吸并电离

3.  样品产生的离子在加速电场的作用下获得相同的动能，经过一个真空无电场飞行管道，较轻的离子速度快，较早到达检测器，较重的离子较晚到达检测器，飞行时间与(m/z)成正比

MALD-MS最适合蛋白质水解后的肽混合物及微量样品(fmol-amol)的分析

MALDI-TOF-MS工作原理

2. 电喷雾离子化质谱

electrospray ionization mass spectrometry

简称：ESI-MS

原理：

1. 利用高电压使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电

2. 在逆向气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面缩小，表面电荷密度不断增加，液滴爆裂为带电的子液滴

3. 不断重复 步骤2 使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电压非常强大，使分析物电离并以单电荷或多电荷离子的形式进人质量分析器

质谱峰显示了此化合物带不同电荷的一系列质荷比峰，经软件计算可以转换为带单电荷的分子离子峰。可进行微量样品(fmol-amol)的分析。

ESI-MS 工作原理

3. 串联质谱

简称：MS/MS

原理：

两个或更多的质谱连在一起，称为串联质谱。

1. 第一级质量分析器获得所有组分的分子离子峰，(即母离子)

2. 经质量分析器挑出需进一步分析的母离子

3. 此母离子在 碰推室内 经高流速情性气体 碰撞诱导离解(collision-induced dissociation, CID) 产生碎片离子(子离子)

4. 子离子进人第二级质量分析器获得母离子的碎片峰。

优点：可选择性分析混合物中的某个组分而不必将各组分开 / 通过研究母离子和子离子的裂解关系，可以获得多肽和蛋白质的结构信息

分类：串联四级杆质谱 / 四级杆离子阱质谱 / 飞行时间/飞行时间质谱 / 傅里叶回旋共振质谱…

MALDI-TOF-TOF MS示意图

8） 质谱分析基本步骤

样品离子化 ---> 根据质荷比(m/z)不同分离离子 ---> 检测每种质量离子的数目 ---> 收集、处理数据得到质谱图

质谱技术鉴定蛋白质的步骤

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质谱技术在蛋白组学的应用

1）蛋白质的鉴定

基于生物质谱的鉴定方法主要有：

1. MALDI-TOF-TOF，对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，适合于简单蛋白质混合物

2. 串联质谱的肽序列标签（PST），适合于复杂蛋白质混合物。该技术不算常用，如果仅仅是蛋白质鉴定，普通的label free的方法就已经很成熟了，如果是用相对定量，一般还是用TMT/iTRAQ比较流行

3. 肽段的从头测序（de novo sequencing），对蛋白质数据库不存在待鉴定的蛋白质

LC-MS/MS 蛋白质鉴定流程

蛋白质鉴定一般流程

2）蛋白质的定量分析

定义：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系的所有蛋白质进行精确的定量和鉴定。

分析原理：

1. 不同蛋白质和多肽在质谱仪中离子化能力不同，从质谱图中不能得到量的信息

2. 对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽可以通过比较质谱峰的强度或峰面积得到待比较蛋白质的相对量

分析方法：

1. 荧光染色差异显示双向电泳（2D-DIGE）

2. 同位素代谢标记（SILAC）

3. 同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）

4. 基于Label Free的定量蛋白组分析

3）荧光染色差异显示双向电泳 2D-DIGE

2D-DIGE使用三种荧光染料（Cy2, Cy3和Cy5）标记不同组别的蛋白，并在同一张凝胶上对标记好的三组蛋白混合物进行电泳分离，是一种多通道分离技术。

优点：可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或处理样本的蛋白质表达谱

4）基于同位素标记的蛋白组分析

分类：

代谢标记法 - 15N标记法 / 细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC）

化学标记法 -  ICAT法 / iTRAQ法

介绍：

15N标记法 - 含有15N的培养基培养若干代细胞直至蛋白质被同位素完全标记，等量混合未标记/标记的样本，液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量，根据质谱图中成对峰的面积之比，可以判断同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图可以对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白

SILAC法（较为先进） - 采用含有轻 / 中 / 重同位素型必须氨基酸的培养基培养细胞，蛋白质被同位素稳定标记后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定

5）同位素代谢标记SILAC方法

原理：采用含有轻 / 中 / 重同位素型必须氨基酸的培养基培养细胞，蛋白质被同位素稳定标记后分离和质谱鉴定，根据一级质谱图中三个同位素型肽段的面积比较进行相对定量和二级谱图对肽段进行序列测定

优点：

高效性 / 定量精确 / 高通量 / 高灵敏度 /  相容性 / 灵活性

6）同位素代谢标记SILAC方法

优点：

高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%

定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异

高通量 / 高灵敏度：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检测可达到纳克级水平

相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记

灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便

7）基于同位素标记的蛋白组分析

分类：

代谢标记法 - 15N标记法 / 细胞培养中含有稳定同位素的氨基酸标记法（SILAC）

化学标记法 -  ICAT法 / iTRAQ法

介绍：

ICAT法 - 不同样本的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多态，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段

iTRAQ法 - iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基以及赖氨酸侧链氨基链接的胺标记同重元素。在质谱图中，任意一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中，型号离子表现为不同的质荷比的峰，因此根据波峰的高度以及面积，可以鉴定出蛋白质和分析除同一蛋白质不同处理的定量信息

8）同位素化学标记iTRAQ法

原理：iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基以及赖氨酸侧链氨基链接的胺标记同重元素。在质谱图中，任意一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中，型号离子表现为不同的质荷比的峰，因此根据波峰的高度以及面积，可以鉴定出蛋白质和分析除同一蛋白质不同处理的定量信息

iTRAQ标签包括三部分：

报告基团（reporter group）：指示蛋白样品丰度水平

平衡基团（balance group）：平衡报告基团的质量差，使等重标签重量一致，保证标记的同一肽段m/z相同

肽反应基团（amine-specific reactive group)：能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接，从而标记上肽段

9）基于Label Free的定量蛋白组分析

定义：Label-free 是一种非标记的差异蛋白质组学技术，

原理：

该技术不使用同位素标记物，而是直接根据质谱峰的强度来对肽段或蛋白进行相对定量。

不同样本提取的蛋白质经酶解后产生的肽段分别采用LC-MS/MS技术分离，特定软件检索原始质谱数据，解析出不同样本中各个肽段的定量信息，进而获得蛋白质在不同样本中的定性和定量信息。

Label Free的定量分析

10）蛋白质的翻译后修饰

分类：磷酸化 / 去磷酸化 / 甲基化 / 乙酰化 / 泛素化 / 去泛素化 / 糖基化…

作用：

1. 磷酸化和去磷酸化这一可逆过程调节着包括细胞增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动

2. 在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生着磷酸化修饰

3. 蛋白质磷酸化可以发生在多种氨基酸上，其中以丝氨酸 (S) 最多、苏氨酸 (T)次之、酪氨酸 (Y) 相对较少

11）蛋白质相互作用

分析方法：

主要有两种策略

1. 分离获得结合蛋白，再用SDS-PAGE分离，然后进行胶内酶切及串联质谱分析；

2. 将混合蛋白质直接酶解，用串联质谱鉴定。

分析步骤:

1. 诱饵设置（抗体免疫亲和沉淀技术及用标签标记蛋白质后提取标记蛋白质进而获得目的蛋白）

2. 复合物亲和纯化

3. 相互作用分析：通过运用蛋白质相互作用分析软件如Maxquant、Osprey、PIN、Cytoscape等进行分析。

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