芝加哥大学：m6A RNA修饰在哺乳动物转录组中以单碱基分辨率进行测量

背景

RNA修饰已经成为基因表达程序的重要调控因子。哺乳动物中最丰富的内部mRNA修饰是m6A。m6A修饰对多种生物过程具有重要的生理作用。尽管RNA m6A甲基化很重要，但缺乏一种用化学计量信息绘制全转录组m6A位点的定量方法。这种方法将允许评估单个m6A位点对生物学功能的贡献，并能够分析和比较细胞分化、细胞信号或应激反应期间潜在的全局动态变化。

简介

2022年3月14日，来自美国芝加哥大学的Lulu Hu及其团队在Nat Biotechnol (IF: 36.558)杂志上发表名为m6A RNA modifications are measured at single-base resolution across the mammalian transcriptome的研究[1]。

主要结果

m6A-SAC-seq的策略和发展。  为了以单核苷酸分辨率检测和定量跨转录组的m6A水平，我们开发了m6A-SAC-seq。该方法使用了二甲基转移酶的Dim1/ KsgA家族，该家族将甲基从S-腺苷-l-甲硫氨酸 (SAM)转移到腺苷，在连续的甲基化反应中形成m6A，然后形成N6，N6-二甲基腺苷 (m62A) (图1a)。

图1. m6A-SAC-seq策略与发展

区域特异性m6A对mRNA的衰减和翻译效率的影响。  为了揭示区域特异性m6A与mRNA代谢之间的关系，我们将5'-UTR-m6A-only、3'-UTR-m6A-only和CDS-m6A-only转录物根据其在转录物特定mRNA区域 (3'-UTR、5'-UTR或CDS)的m6A部分之和分为三组 (高、中、低)，确定相等数量的转录物，并分别确定了敲除m6A写入器 (METTL3)或读取器 (YTHDF1/YTHDF2)对其寿命和翻译效率的影响。对于所有转录物和3'-UTR-m6A-only和CDS-m6A-only转录物，我们观察到具有高m6A化学计量比的转录物的寿命比具有低m6A化学计量比的转录物的寿命短 (图3a)。METTL3或YTHDF2的敲除导致RNA寿命延长，尤其是对于修饰程度更高的转录物，这证实了m6A在mRNA转换中的主要作用。值得注意的是，我们的分析显示，5'-UTR-m6A-only的转录物往往比未修饰的转录物以及3'-UTR-m6A-only和CDS-m6A-only的转录物显示出更长的寿命 (图3b，c)。此外，YTHDF2的耗竭导致这些转录物的稳定性降低，表明YTHDF2对5'-UTR-m6A-only的转录物具有直接或间接的稳定作用 (图3c)。

图3. m6A 对细胞系中修饰 RNA 的影响

动态m6A水平与基因表达变化相关。  m6A修饰可以标记和启动协同衰变和翻译的转录本，从而促进细胞分化过程中的转录组转换和蛋白质产生。我们鉴定了4406个m6A修饰的转录物，它们在任何两个连续时间点之间差异表达 (FC>1.5或FC<0.667，FDR < 0.05，图5a)。其中，编码对单核细胞发育调节至关重要的TFs的转录物在HSPC分化期间显示出m6A化学计量比变化以及表达水平变化 (图5b)。例如，KLF4的CDS中m6A甲基化的化学计量比随着从d6到d9的转录水平的丰度而增加；对在d0-d3转变点的EGR1 CDS m6A甲基化也进行了类似的观察。其他实例包括3'-UTR m6A甲基化在ERG1、SPI1和CEBPA中的m6A化学计量比变化，这种变化在m6A化学计量比中降低，在d0-d3转变时转录物丰度增加。

图5 . 单核细胞形成过程中m6A修饰影响基因表达

结论及展望

虽然RNA m6A修饰在细胞分化、组织发育和转录调控中发挥着关键作用，但由于测序材料有限和缺乏跨条件比较m6A水平的稳健方法，这些生物学过程的研究受到了阻碍。

我们提出了一种定量的m6A-SAC-seq方法，可在单碱基分辨率下绘制整个转录组中的m6A位点。该方法只需要~30ng的输入RNA (来自300ng的总RNA)，因此适用于研究各种生物系统。我们以单碱基精度和化学计量信息绘制了详细的m6A综合图。m6A-SAC-seq确实显示出GAC优先于AAC的基序偏好。以前使用色谱法、miCLIP6和miCLIP2进行的研究报告，约70-75%的m6A位点出现在GAC基序中。这表明，尽管m6A-SAC-seq仍可揭示AAC基序中高度修饰的m6A位点，但m6A-SAC-seq仍可揭示高达约80%的m6A位点，即使在检测AAC位点方面存在局限性。对目前的甲基转移酶进行工程改造以表现出较少的序列偏差是我们希望追求的未来方向。此外，我们的定量测序数据显示，三种不同细胞系 (HeLa、HEK293和HepG2)之间存在大量细胞类型特异性m6A位点，与我们观察到的MeRIP-seq数据显示这些细胞系之间有35-50%的共有峰一致。将m6A-SAC-seq应用于单核细胞拓扑结构，可对细胞分化过程中的m6A沉积和化学计量动力学进行定量描述，揭示了对细胞分化重要的关键转录物的广泛m6A动力学，并发现了新的m6A相互作用蛋白候选物。本研究展示了在各种细胞分化、早期发育、神经元信号传导和临床样本中广泛应用m6A-SAC-seq获得全转录组m6A化学计量比图谱的潜力。因此，我们认为m6A-SAC-seq将作为克服目前m6A定量测序的技术瓶颈，实现新的生物学发现的一种金标准。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01243-z

参考文献

1.Hu Lulu,Liu Shun,Peng Yong et al. mA RNA modifications are measured at single-base resolution across the mammalian transcriptome.[J] .Nat Biotechnol, 2022, undefined: undefined.

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