Nat Cell Biol：METTL16发挥独立于m6A的功能，促进翻译和肿瘤发生

背景

N6-甲基腺苷 (m6A)作为哺乳动物信使RNA中最普遍的内部修饰，通过调控靶RNA的命运在正常的生物过程和发育中发挥重要作用，其调控异常与包括癌症在内的多种疾病有关。尽管由METTL3和METTL14组成的m6A甲基转移酶复合物被认为是主要的m6A写入者，但METTL3和METTL14的耗竭导致某些细胞类型的m6A修饰仅减少约60%，并且纤维素中的大部分m6A标记与METTL3和METTL14的结合位点不匹配。这些观察结果表明存在其他m6A甲基转移酶。人类甲基转移酶样蛋白 (METTL)属于一个由30多个成员组成的超家族，具有保守的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)结合位点。然而，大部分METTL蛋白的功能和相关分子机制尚不清楚。METTL16最近被鉴定为m6A甲基转移酶，但据报道，它仅将m6A添加到几个非编码RNAs U6小核RNA、MALAT1和XIST以及一个mRNA靶标 (MAT2A)中。尽管有一项研究报告了METTL16在小鼠胚胎发育中的作用，但尚未研究其在正常发育和疾病 (例如，癌症)中的生物学功能。

简介

2022年2月10日，来自美国贝克曼研究所的Rui Su及其团队在Nat Cell Biol (IF: 20.042)杂志上发表名为METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis的研究[1]。

主要结果

METTL16 将 m6A 沉积到一小部分 METTL16 结合的 mRNA 转录物中。在对两个独立的大规模全基因组聚集的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 敲除 (KO) 筛选数据集的分析中，我们发现，在 METTL 家族成员中，METTL16 是绝大多数癌细胞存活的最重要的基因，暗示其在癌症中的功能重要性。免疫荧光测定表明，METTL16 定位于正常细胞（HEK293T；图 1a）和癌细胞（Huh7）的细胞核和细胞质中。与主要位于细胞核中的 METTL3 METTL14 不同，大部分内源性 METTL16 分布在细胞质中（图 1a-c）。异位表达的宽型或突变体（催化死亡突变 F187G 和 PP185/186AA，以及催化活性突变 R200Q）METTL16 也显示出类似的模式。如前所述，m6A 修饰以共转录方式安装在细胞核中。因此，除了催化 m6A 的形成，METTL16 可能发挥额外的功能，特别是在细胞质中。

图1. METTL3、METTL14、METTL16的亚细胞分布及m6A催化活性比较分析

METTL16通过与细胞质中的eIF3a/b相互作用促进翻译起始。  为了阐明METTL16对翻译促进作用的潜在机制，我们试图研究其在翻译起始中的参与和作用，因为起始，而不是延伸或终止，通常是翻译中最紧密协调的限速步骤，并且METTL16定位于5’ cap区。eIF3作为最大的启动因子，通过充当mRNA、40S亚基和其他eIF募集的支架而发挥关键作用，是刺激翻译启动几乎所有步骤不可或缺的因子。使用eIF3复合物进行的蛋白免疫印迹分析表明，METTL16可能直接且特异性地与eIF3a/b和/或eIF3c结合 (图3a，b)。随后的共免疫沉淀 (Co-IPs)证实了METTL16和eIF3a/b之间的直接相互作用，但没有eIF3c (图3c，d)。此外，它们的相互作用不依赖于RNA。原位接近连接试验 (PLA)进一步验证了METTL16和eIF3a/b之间的物理相互作用 (图3e)。如预期，大部分原位PLA斑点位于细胞质而非细胞核中 (图3f，g)。与METTL16 KO相似，eIF3a和eIF3b KO显著抑制了翻译效率 (图3h，I)。在蔗糖密度梯度上，METTL16与eIF3a/b一起在40S、60S和80S核糖体中强烈富集 (图3j)，表明METTL16和eIF3a/b同时存在，并且参与翻译起始。此外，大约一半的eIF3a-或eIF3b-结合转录物也直接与METTL16结合；超过40%的在METTL16 KO之后具有抑制的翻译效率的转录物也直接被eIF3a和eIF3b结合 (图3k，l)。METTL16的催化功能增加或丧失突变不影响其与eIF3a/b的相互作用，与我们的观察结果一致，即METTL16介导的翻译促进与其甲基转移酶活性无关。

图3. METTL16 通过与 eiF3a/b 直接相互作用促进翻译启动

METTL16 与 eIF3a/b 和 rRNA 的相互作用促进了 80S TIC 的形成。  引人注目的是，我们发现 METTL16 还直接与核糖体 RNA 相互作用，其程度与其已知靶标的相互作用相当。这种关联不会发生在其他 METTL 成员中，例如 METTL3，尽管它也增强了翻译。用截短的 METTL16 突变体交联免疫沉淀和定量 PCR (CLIP-qPCR) 证明 Mtase 结构域对于 METTL16 和 rRNA 之间的相互作用也是至关重要的 (图 5a-d)。因此，我们假设 METTL16 与 eIF3a/b 和 18S rRNA（40S 核糖体亚基的核心）之间的相互作用将促进 eIF3a/b 和 18S rRNA 之间的结合，进而促进 eIF3 复合物与 40S 核糖体亚基的相互作用。METTL16 KD 显着抑制了 eIF3a/b 和 18S rRNA 之间的相互作用，而 METTL16 的恢复可以充分挽救被抑制的关联（图 5e-h）。METTL16 与 rRNA 在翻译起始部分的结合能力远强于多聚体中的结合能力（图 5i-k），这突出了 METTL16 与 TIC的关系。此外，我们推测 METTL16 和 28S 5.8S rRNA（60S 核糖体亚基的核心）之间的相互作用可能进一步将 60S 亚基募集到 eIF3 40S 亚基复合体（即 43S PIC）中，从而促进形成80S TIC。我们的核糖体谱显示 METTL16 KO 显着减少了 80S 核糖体的形成（图 5l-n）。体外翻译实验直接验证了 METTL16 增强了翻译能力（图 5o）。据报道，METTL16可以增强细胞核中某些靶标（例如MAT2A）的保留内含子的剪接，这反过来可以保护靶标免于衰变并促进它们转运到细胞质中，从而增强了靶标的翻译。然而，根据Pendleton和同事生成的数据，只有296个转录物在METTL16耗竭细胞中显示出显著 (P < 0.05)的内含子保留增加。在METTL16缺失细胞中翻译效率降低的3638个转录物中，只有117个伴有内含子保留增加，表明METTL16介导的翻译促进与其在内含子剪接中的作用在很大程度上无关。METTL16 eIF3a/b 和 METTL16 18S rRNA（40S 核糖体亚基）相互作用共同刺激 eIF3 复合物和 40S 核糖体亚基之间的相互作用，从而促进 43S PIC 的组装；额外的 METTL16 28S 5.8S rRNA（60S 亚基）相互作用随后促进了 80S TIC 的形成，因此促进了翻译起始（图 5p）。

图5. METTL16 通过与 eIF3a/b 和 rRNA 的相互作用促进 TIC 的形成

结论及展望

我们的观察结果和既往研究表明，METTL3 METTL14主要位于细胞核中，而METTL16优先位于细胞质中。因此，在促进细胞质中的翻译方面，METTL16可能比METTL3发挥更有效的作用。我们发现METTL16比METTL3更能促进有效翻译。两个大规模CRISPR Cas9筛选数据集一致表明，对于各种类型的人类癌细胞的生存，METTL16是比METTL3、METTL14和任何其他METTL基因更重要的基因。在本研究中，我们证明了METTL16在肝癌中起关键的促瘤作用，其中METTL16过表达，其表达增加与预后不良相关。METTL16的遗传耗竭显著抑制了人类肝癌细胞的生长、迁移和侵袭，并在体内强有力地抑制了肿瘤生长，同时伴随着全局m6A和翻译的显著减少。我们发现翻译调控中约50%的METTL16靶位也是eIF3a/b的潜在靶位，并且eIF3a/b在HCC中也发挥潜在的致癌作用。因此，靶向METTL16 eIF3a/b轴代表了一种新的癌症治疗策略 (例如，HCC治疗)。鉴于METTL16的Mtase结构域对其甲基化依赖性和非甲基化活性都至关重要，因此开发针对Mtase结构域的有效抑制剂将是充满希望的，并在癌症治疗中具有巨大的治疗潜力。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41556-021-00835-2

参考文献

1.Su Rui,Dong Lei,Li Yangchan et al. METTL16 exerts an mA-independent function to facilitate translation and tumorigenesis.[J] .Nat Cell Biol, 2022, 24: 205-216.

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