实验笔记丨Transwell实验检测细胞侵袭能力

Transwell侵袭实验是检测肿瘤细胞侵袭能力最常用的实验方法，其原理是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被Matrigel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力，原理图下图所示：

在开始消化铺板之前，我们需要给Transwell小室提前铺上人工基质胶，人工基质胶与coatingbuffer的比例为1:40，混好人工基质胶后加入Transwell小室中，再把Transwell小室放入深孔24孔板中一起放进细胞培养箱赙育2小时。

孵育结束后用移液器把多余的人工基质胶吸出弃掉，再用相应的纯培养基清洗两道三次，去除残余的人工基质胶。

接着我们对细胞进行铺板，用胰蛋白酶消化液把贴壁细胞消化下来，吹打混匀后上细胞计数仪进行细胞计数。Transwell小室里面我们铺上10万个细胞，并且保证小室内为无血清培养基0.2 ml，在放置Transwell小室的深孔24孔板中加入700微升的带有血清的完全培养基，血清就起到了趋化因子的作用可以使得细胞从Transwell小室的无血清环境中，迁移到24孔板有血清的环境中。

根据不同细胞的迁移情况选择在24-48小时取出Transwell小室，去细胞进行后续处理。首先，取出小室后用PBS清洗几遍，动作要轻柔避免人为因素导致细胞脱落。接着用棉签擦去小室上未穿过去的细胞，再次用PBS清洗干净，紧接着把小室放入甲醇中固定15-20分钟，防止细胞在染色冲洗时脱落。

固定结束后也要用PBS清洗去除甲醇的影响，清洗后把Transwell小室放入终浓度为0.1%的结晶紫染液中染色半个小时，然后再把染色液用流水冲洗干净。最后把冲洗好的小室放在显微镜下观察拍照。

1×磷酸缓冲盐溶液（1×PBS）配方：

精确称量上述药品至容器中，先加入800毫升的MilliQ水，用磁力搅拌器充分搅拌使其完全溶解，在用酸碱度测定仪测量pH值，并用盐酸调节pH值到7.4，然后再次用MilliQ水定容到1升，最后放入高压灭菌锅内进行高压灭菌，冷却至室温后即可放入４度冰箱保存。

Transwell小室人工基质胶缓冲液（Transwell coating buffer）配方：

精确称量上述药品至容器中，用双蒸水定容到100毫升，充分搅拌使其完全溶解混匀，然后在超净工作台（提前灭好菌）中用洁净未拆封的注射器和0.22微米的滤膜进行过滤，把滤液放置于灭过菌的洁净的蓝盖瓶中４度保存以备使用。

终浓度为0.1%的结晶紫染色液（100 ml）配方：

精确称量上述药品至容器中，用甲醇定容到100毫升，用磁力搅拌器充分搅拌使其完全溶解，然后再用规格为0.45 μm的过滤器和注射器过滤掉杂质并用锡箔纸包裹，放置于室温保存以备使用。

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