实验笔记丨贴壁细胞的培养及转染

人宫颈癌细胞Hela等实验常用细胞为贴壁生长，在此介绍相关的细胞培养技术注意事项以及基础的转染实验。

以Hela细胞系为例，在培养细胞时完全培养基的配置比例为：90% DMEM＋10% FBS，另外根据需要加入百分之一的双抗（SP）。细胞在培养时不但应注意无菌操作，而且在把细胞放入细胞培养箱中培养时也要确保温度恒定在37摄氏度，且二氧化碳浓度保持在百分之五。

贴壁细胞的培养

（１）贴壁细胞的复苏

在准备进行细胞复苏实验时，应提前做好一下两点准备：1.提前把超净工作台紫外灭菌30分钟；2.提前把水浴锅打开，使水温保持在37摄氏度，并预热复苏细胞所用的培养基。上述准备工作完成以后就可以从液氮中取出保存的细胞，本着“慢冻速融”的原则，把细胞放进水温３７摄氏度的水浴锅中并不断搅拌，使冷冻的细胞迅速融化，最大限度的保存细胞的活力，这个过程最好在两分钟之内完成。细胞解冻后放在离心机中以1000 rpm的转速离心3-5分钟，离心结束小心弃去上清，并用提前预热的完全培养基把细胞吹打混匀，再转移至规格合适的培养器皿中，放入细胞培养箱培养即可。

（２）贴壁细胞的传代

当我们在准备给贴壁细胞进行传代的时候应该确认以下两点：1.先把细胞从细胞培养箱中拿出，放在显微镜下观察，确保细胞状态良好，没有污染；2.观察细胞的汇合度达到70%-90%，细胞汇合度太低或者太高时对细胞进行传代均不利于细胞生长。只有满足这两点基本条件，我们才能给细胞传代。给细胞传代时，首先我们弃去培养基，用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完全培养基终止细胞消化，消化时间要把握好，消化时间太短细胞没有消化下来，时间太长则会影响细胞活性。消化下来的细胞吹打混匀后以1:3-5的比例分装到新的培养器皿中再加入足量的完全培养基继续扩大培养。

（３）贴壁细胞的冻存

冻存细胞时，首先我们弃去培养基，用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗细胞2-3次，动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞，消化过程中把细胞放在显微镜下观察，直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完全培养基终止细胞消化，消化下来的细胞吹打混匀后，按照以下比例混匀放入冻存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30％细胞悬液＋10%二甲基亚砜（DMSO）。特别值得注意的是，在冻存管上要标注清楚冻存的细胞名称，细胞冻存的时间，冻存细胞的代数等信息。本着“慢冻速融”的原则，我们把写好信息的冻存管放入慢冻盒中，放入负八十度冰箱冷藏十二个小时后再把细胞取出放入液氮中保存。

贴壁细胞的转染

在准备做细胞转染的前一天我们把细胞铺进细胞培养皿中，加入完全培养基培养24小时，使得细胞汇合度达到百分之六十到百分之八十。在转染前需要把完全培养基换成无双抗的完全培养基，以排除双抗对转染效率的影响。根据转染的细胞数不同选取适量的纯培养基分别稀释质粒和lipo3000，其中稀释完的质粒中加入p3000充分混匀后再加入稀释过的lipo3000中，把混合液轻柔的吹打混匀，室温孵育20分钟。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中，然后再轻轻摇匀，放入细胞培养箱中继续培养6个小时，再更换成带有双抗的完全培养基即可。

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