新热点“衰老”在非肿瘤研究中的应用

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最近，衰老作为新的热点，被应用于各类肿瘤疾病研究中。

而今天和大家分享一篇于今年一月份发表的衰老基因与非肿瘤疾病相结合的文章，即动脉粥样硬化中基于年龄的诊断基因特征和免疫浸润多样性分子亚型的角色塑造！

一、摘要

目的：高龄是动脉粥样硬化（AS）的主要危险因素。然而，这种现象背后的机制仍然不清楚。在此，本研究对 AS 中衰老相关基因的生物学意义进行了全面分析。

方法：AS 和非 AS 样本的基因表达谱来自 GEO 数据库。采用差异表达分析筛选AS特异性衰老相关基因。提出LASSO回归分析构建诊断模型，并用ROC曲线评估判别能力。通过共识聚类分析，进行了基于衰老的分子亚型。根据 HLA 的表达、免疫检查点和免疫细胞浸润来估计免疫水平。然后通过 WGCNA 鉴定关键基因。用蛋白质印迹和 ELISA 检查 CEBPB 敲低对巨噬细胞极化的影响。此外，将巨噬细胞暴露于 100 mg/L ox-LDL 48 小时以诱导巨噬细胞泡沫细胞。

结果：本研究确定了 28 个 AS 特异性衰老相关基因。开发了与衰老相关的基因模型，可以在GSE20129 (AUC = 0.898) 和GSE43292 (AUC = 0.685) 数据集中准确诊断 AS。基于 AS 特异性衰老相关基因的表达谱，两种分子亚型聚集在一起，并具有不同的免疫浸润特征。与免疫激活显着相关的 WGCNA 获得了分子亚型相关基因。抑制CEBPB 触发抗炎 M2 样极化并抑制泡沫细胞形成。

结论：研究结果表明衰老相关基因在诊断 AS 和调节免疫浸润方面具有重要意义。

二、流程图

三、结果简述

1.AS中衰老相关基因的表达模式及生物学意义

这项研究从 HAGR 中收获了 307 个与衰老相关的基因。GSE20129数据集的 AS 和非 AS 样本中分析了衰老相关基因的表达模式。结果表明，MAPK14、PTGS2、SP1、SOD2、BAK1、MXD1、GSK3B、CEBPB、STAT5B、MAP3K5、FAS、LMNB1、PPP1CA、VCP、PSEN1、ERCC1、HTRA2、PYCR1、EFEMP1 和 AGTR1 表达在 AS 中比在非 AS 样本中显着上调(图1A、B）。同时，与非 AS 样本相比，PPARG、ABL1、SHC1、ERCC4、ERCC3、PARP1、APEX1 和 ERCC5 在 AS 中表现出更明显的下调。上述基因被认为是AS特异性衰老相关基因。通过 Pearson 相关性检验，在 mRNA 水平上，AS 样本中 AS 特异性衰老相关基因之间存在显着的正相关或负相关。( 图 1C）。此外，PPI 网络揭示了由 AS 特异性衰老相关基因编码的蛋白质之间的密切相互作用。( 图 1D）。KEGG富集结果表明，AS相关（脂质和AS）和免疫相关通路（TNF和IL-17信号通路）被AS特异性衰老相关基因显着富集。( 图 1E）。如 GO 注释结果所示，AS 特异性衰老相关基因与氧化应激、衰老和 DNA 修复显着相关( 图 1F）。

2.用于 AS 诊断的衰老相关基因特征的开发

通过 GSEA 方法评估 AS 和非 AS 样本之间生物过程和途径的激活差异。研究结果表明，AS样本中的血液循环、循环系统过程、胚胎形态发生、激素水平的调节和系统过程的调节被显着激活(图 2A）。同时，粘着斑、HIF-1 信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、PI3K-Akt 信号通路和 TNF 信号通路在 AS 样本中表现出增加的激活(图 2B）。这表明上述生物学过程和途径可以参与 AS 进展。通过LASSO方法，筛选出特征AS特异性衰老相关基因。在此基础上,构建了一个包含 18 个 AS 特异性衰老相关基因用于 AS的诊断模型 (图 2C、D）。其中，CEBPB、MAPK14、BAK1、ERCC1、FAS、EFEMP1、MAP3K5、AGTR1、PYCR1、VCP 和 PPP1CA 在 AS 中的表达较非 AS 样本增加（图 2E）。同时，与非 AS 标本相比，AS 中的 ERCC3、ABL1、PARP1、ERCC4、SHC1、ERCC5 和 PPARG 显着降低。GSE20129和GSE43292数据集中的 AUC 值分别为 0.898 和 0.685 （图 2F）。这证实了该模型的出色诊断性能。在GSE21545数据集中，生存分析揭示了关键 AS 特异性衰老相关基因对 AS 患者的重要预后意义(图 2G–X）。

3.AS 样本中两个与衰老相关的基因簇的表征

深入评估AS 和非 AS 样本之间的免疫浸润差异。与非 AS 样本相比，我们发现 AS 样本中中央记忆 CD8 T 细胞和中性粒细胞的浸润水平显着增加（图 3A）。同时，在 AS 样本中观察到 CD56 bright 自然杀伤细胞的浸润水平降低。如图 3B所示，与非 AS 样本相比，AS 中 HLA-E 和 HLA-DPB1 的表达显着增加，而 HLA-DRB5 的表达降低。还比较了 AS 和非 AS 标本之间免疫检查点的表达。与非 AS 样本相比，TNFSF14 的表达显着增加，但 ICOSLG 和 TNFRSF25 在 AS 样本中的表达显着降低（图 3C）。上述数据表明 AS 和非 AS 样本之间免疫浸润的异质性。我们进一步研究了特征衰老相关基因特征与 AS 样本中免疫浸润的相互作用。如图 3D所示，大多数特征与衰老相关的基因与免疫细胞浸润有关。特征性衰老相关基因与HLA-A、HLA-B、HLA-DMA、HLA-DRB5、HLA-E、HLA-F呈正相关，与HLA-DQA2呈负相关。此外，它们与其他 HLA 分子呈正相关或负相关（图 3E）。此外，在 AS 标本中，特征性衰老相关基因与 HLA 和免疫检查点之间存在显著关联（图 3F）。

4.具有不同免疫激活的衰老相关基因簇

通过共识聚类分析，我们根据 AS 特异性衰老相关基因的表达谱将 AS 样本聚类为两个分子亚型，即簇 1（n = 20）和簇 2（n = 28）（图 4A-D）。t-SNE 图揭示了来自两个集群的样本之间的显着差异（图 4E）。如图 4F，AS特异性衰老相关基因的表达在亚型之间表现出明显的异质性。我们还调查了 AS 样本中标志性途径的活动。在图 4G与集群 2 相比，在集群 1 中发现糖酵解、MYC 靶点、未折叠蛋白反应、IL-2-STAT5 信号传导、同种异体移植排斥、过氧化物酶体、雄激素反应、蛋白质分泌、胆汁酸代谢和 E2F 靶点的激活减少。

5.具有不同免疫活性的衰老相关基因簇

通过 ssGSEA 量化来自衰老相关基因簇 1 和 2 的 AS 样本中免疫细胞亚群的浸润水平。在图 5A，我们注意到与簇 1 中的那些相比，中枢记忆 CD4 T 细胞和效应记忆 CD8 T 细胞在簇 2 中表现出显着增加的浸润水平。相比之下，在簇 2 中发现了更高的巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞的浸润水平。簇 1 比簇 2。簇 1 中的 HLA-DRA、HLA-DMB 和 HLA-DPA1 表达明显低于簇 2（图 5B）。此外，发现包括 CD160、CD27、CD48、HAVCR2、ICOS、LAIR1、TMIGD2 和 TNFRSF25 在内的免疫检查点在集群 2 中的表达明显高于集群 1。然而，集群 1 中 TNFRSF9 和 TNFSF14 的表达明显高于集群 1集群 2 (图 5C）。因此，衰老相关基因簇 2 在 AS 中表现出高免疫激活。

6.共表达网络的建立

在输入数据的质量检查之后，没有样本被移除（图 6A）。在这里，进行了两种表型（集群 1 和 2）。在图 6B、C，软阈值功率设置为5，而无标度拓扑拟合指数高达0.9，表示近似无标度拓扑。利用动态树切割分析建立共表达模块。总共有 14 个模块被合并并用唯一的颜色标识（图 6D）。灰色模块包含不具有相似表达模式且不属于任何其他模块的基因。如图 6E所示，绿色模块与衰老相关的簇显示出最显着的相关性，表明绿色模块中的基因与衰老相关的簇有关。

7.衰老相关共表达模块中的基因分析

我们在绿色模块中鉴定了 49 个与衰老相关簇高度相关的共表达基因（图 7A）。通过 MCODE，LYN、MCL1、NFKB2、CREB1、CREBBP、NOTCH1、MAPK14、MAPK1、RAF1、CDC42、GSK3B、CXCR4 和 CFLAR 作为枢纽基因（图 7B）。利用功能富集分析，以揭示绿色模块中基因的生物学意义。在图 7C中性粒细胞活化、中性粒细胞参与免疫反应的活化、中性粒细胞介导的免疫、中性粒细胞脱粒、细胞因子产生的正向调节、白细胞趋化性和T细胞活化等免疫相关生物学过程显着丰富。此外，我们注意到 AS 相关（如脂质和 AS、HIF-1 信号通路、VEGF 信号通路、JAK-STAT 信号通路、TNF 信号通路和坏死性凋亡）和免疫相关（趋化因子信号通路、Th1 和 Th2细胞分化、Th17 细胞分化和 B 细胞受体信号通路）通路被绿色模块中的基因显着富集（图 7D）。

8.CEBPB 敲低触发巨噬细胞的抗炎性 M2 样极化

在 AS 特异性衰老相关基因中，CEBPB 与 AS 中的免疫细胞浸润显着相关，尤其是巨噬细胞。为了研究 CEBPB 对巨噬细胞的作用，抑制 CEBPB 在巨噬细胞中的表达（图 8A）。将巨噬细胞暴露于 20 ng/ml IFN-γ 和 10 pg/ml LPS 以获得 M1 巨噬细胞或与 20 ng/ml IL-4 一起孵育以获得 M2 巨噬细胞。在 M1 巨噬细胞中发现 CEBPB 表达增加，在 M2 巨噬细胞中其表达减少（图 8B）。M1 样巨噬细胞中 M1 型标志物（iNOS）的表达升高，而 M2 型标志物（包括 FIZZ1、Ym1 和 Arg1）的表达降低（图 8C-F）。在 M2 样巨噬细胞中研究了相反的结果。特别是，CEBPB 敲低降低了 M1 型标记 (iNOS) 的表达并增强了 M2 型标记 (包括 FIZZ1、Ym1 和 Arg1) 的表达。在蛋白质水平上观察到类似的结果（图 8G-L）。这些数据表明 CEBPB 敲低促进了巨噬细胞的 M2 样极化。ELISA 结果表明，抑制CEBPB 可减少 LPS 诱导的和 IFN-γ 诱导的巨噬细胞中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的增加（图 8M-O）。上述数据表明，抑制 CEBPB 引发了巨噬细胞的抗炎 M2 样极化。

9.敲低CEBPB 会减弱 ox-LDL 诱导的巨噬细胞中的胆固醇摄取、酯化和水解以及外排

本研究通过暴露于巨噬细胞中的 ox-LDL 构建了 AS 细胞模型。Western印迹证实了ox-LDL诱导的巨噬细胞中CEBPB表达的显着上调（图 9A、B）。为了研究 CEBPB 对 AS 进展的影响，CEBPB 表达被显着沉默。胆固醇摄取是一个生物过程，ox-LDL 通过巨噬细胞通过 SR 介导的途径被吸收（Wang 等人，2019 年）。巨噬细胞主要表达一些 SR 蛋白，它们结合、内化和降解 ox-LDL，包括 CD36、LOX-1 和 SR-A。我们注意到 CEBPB 敲低削弱了 ox-LDL 暴露的巨噬细胞中 CD36、LOX-1 和 SR-A 的表达（图 9C-E）。为了维持细胞内胆固醇稳态，过量的胆固醇将主要通过转运蛋白依赖性胆固醇流出途径（如 SR-B、ABCA1 和 ABCG1）从巨噬细胞中去除（Wang 等人，2019 年）。我们的结果显示，CEBPB 沉默后，暴露于 ox-LDL 的巨噬细胞中 SR-B、ABCA1 和 ABCG1 的表达显着增加（图 9F-H）。ACAT1 可以重新酯化游离胆固醇，从而阻断由过量游离胆固醇积累引起的潜在细胞毒性。在图 9I, CEBPB 敲低降低了 ox-LDL 诱导的巨噬细胞中 ACAT1 的表达。CEBPB 敲低减弱了 ox-LDL 诱导的巨噬细胞中的胆固醇摄取、酯化和水解以及外排。

五、总结

衰老是 AS 的重要的危险因素之一。破译衰老触发 AS 的机制对于开发新的治疗策略以减少由于衰老引起的 AS 负担具有重要意义。该研究对AS中的衰老相关基因进行了综合分析。我们的研究结果表明，衰老相关基因特征可以作为 AS 的诊断标志物。ROC曲线证实了AS的优良诊断能力。此外，我们在 AS 样本中开发了两种基于衰老的分子亚型，具有不同的免疫浸润水平。通过 WGCNA，我们确定了参与免疫激活的分子亚型衍生的关键基因。在体外实验中, CEBPB 敲低引发巨噬细胞的抗炎性 M2 样极化以及胆固醇摄取、酯化和水解以及 ox-LDL 诱导的巨噬细胞外排减弱，表明 CEBPB 参与了 AS 进展。

总的来说，本研究构建了一个基于衰老的诊断基因特征和两种在 AS 中具有不同免疫浸润的分子亚型，这表明衰老相关基因在诊断 AS 和调节免疫浸润中的关键意义。

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