2022/4/6 14:47:53 阅读：238 发布者：chichi77
代谢异常是肿瘤的特征之一，也是目前肿瘤研究的热点问题，其中，肿瘤糖酵解代谢更是备受青睐，今天，我们就以发表在oncogene（9.867）上的一篇文章“O-GlcNAc transferase regulates glioblastoma acetate metabolism via regulation of CDK5-dependent ACSS2 phosphorylation”为例学习肿瘤代谢的研究思路。
一、研究思路
1. 通过查阅文献确定研究目标：代谢酶 (OGT)所调节的脂质代谢（连接己糖胺代谢与脂质代谢），胶质瘤；
2. 证明代谢酶OGT及其介导的修饰O-GlcNAcylation在胶质瘤中高表达，且促进其生长（表型）；
3. 证明OGT 促进胶质母细胞瘤细胞中乙酸盐和脂质的积累（现象级机制）；
4. O-GlcNAcylation可依赖CDK5促进 Ser267-ACSS2 磷酸化，阻止ACSS2降解，促进胶质瘤生长（抽丝剥茧，细化机制）；
5. Ser267-ACSS2 磷酸化是CDK5及OGT促进胶质瘤生长的途径（串联机制）；
6. 靶向OGT或CDK5可抑制胶质瘤生长（解决问题）。
二、研究内容
1. 人胶质母细胞瘤中 OGT 和 O-GlcNAcylation 水平升高
作者通过IHC法检测临床样本中OGT 和 O-GlcNAcylation水平，发现肿瘤组织中OGT显著高表达，尤其以IV级胶质瘤（GBM）为著，并发现IV级胶质瘤中存在明显的O-GlcNAcylation修饰（图1）。
Tip1：巧用临床样本，引出问题导向；
图1. 人胶质母细胞瘤中 OGT 和 O-GlcNAcylation 水平升高
2. OGT 对GBM生长必不可少
作者为探究OGT在胶质母细胞瘤中发挥的作用，进一步对其进行基因编辑，并通过体外实验（克隆形成，图2b，d）及体内实验（裸鼠荷瘤，图2i，j）检测OGT对GBM生长的作用，并发现敲减OGT后可显著抑制GBM的生长（图2）。
图2. 克隆形成及裸鼠成瘤检测OGT对GBM生长的作用
Tip2：基因编辑，发现表型
3. OGT 促进GBM中乙酸盐和脂质的积累
结合文献报道，OGT对脂质代谢或有重要调节作用，因此作者通过检测乙酸盐和脂质积累明确对脂质代谢的影响，并发现过表达OGT后可促进乙酸盐代谢酶ACSS2表达（图3a）并促进GBM中脂质（图3c，d）及乙酸盐的积累（图3e，f）。
图3. OGT 促进GBM中乙酸盐和脂质的积累
Tip3：联系现象级别机制（脂质代谢）
4. OGT 促进GBM中脂质代谢的机制
随后，作者发现敲减CGT可显著下调GBM内ACSS2的蛋白水平（图4a），并通过免疫沉淀确定ACSS2的磷酸化位点S267，并预测出上游磷酸化因子CDK5，并敲减CDK5后发现ACSS2的S267磷酸化（图4c），通过过表达CDK5或使用OGA抑制剂（NButGT）均可显著提高ACSS2的磷酸化水平（图4e）。
图4. OGT通过CDK5促进了ACSS2的磷酸化
进一步研究发现，ACSS2的磷酸化可抑制其泛素化降解（图5b），因此，OGT及CDK5可能通过ACSS2-S267来稳定ACSS2的蛋白水平，促进GBM的生长。为验证这一观点，作者通过表达野生型ACSS2及磷酸化位点突变型ACSS2发现过表达S267A突变的ACSS2并不能促进GBM的生长（图5f）。
图5. ACSS2的S267磷酸化可稳定其蛋白水平并促进GBM生长
随后，作者针对CDK5促进GBM生长是否是依赖于ACSS2的S-267磷酸化这一问题进行研究。作者发现敲减CDK5后，可抑制GBM的生长及ACSS2的蛋白水平（图6f），并发现CDK5对GBM的作用依赖于ACSS2的S267磷酸化，其中S267A突变可抑制ACSS2的磷酸化，而S267D不能抑制，而相应的，过表达S267A的GBM并不能逆转CDK5敲减的效果，但过表达野生型及S267D的ACSS2可逆转CDK5的抑制作用（图6g, h）。
图6. CDK5对GBM生长的促进作用依赖于对ACSS2的S267磷酸化
同样的，作者对CGT对GBM的生长是否依赖于ACSS2的S267磷酸化进行了验证，通过裸鼠荷瘤实验发现，敲除CGT并过表达S267A可有效抑制GBM生长，而过表达S267D并无此种效果（图7），因此CGT对GBM生长的促进作用也是依赖于ACSS2的S267磷酸化的。
图7. CGT对GBM生长的促进作用依赖于ACSS2的S267磷酸化
Tip4：要明确这种调控机制，可以朝着以下几个方向考虑：（1）修饰，如磷酸化，泛素化，乙酰化以及新发现的乳酸化等等，而这种修饰，最好找见修饰位点；（2）做好逻辑之间的递进及依赖，如CGT依赖于CDK5，依赖于ACSS2的磷酸化；（3）在研究机制的同时要做表型的验证，会更有说服力。
5. 靶向OGT及CDK可抑制GBM生长（解决问题）
上述内容陈述了CGT依赖于CDK5调控了ACSS2的S267磷酸化促进了GBM中的脂质代谢，明确了研究机制，紧接于此，作者通过使用靶向CGT（Ac-5S-GlcNAc）及靶向泛CDK的抑制剂（dinaciclib）研究是否可抑制GBM生长。作者发现，靶向抑制CGT（图8a）及CDK（图8c，e）可有效抑制GBM生长，且这种作用或许于ACSS2的S267磷酸化有关。
Tip5：要选取好的模型，文中使用的是原位肿瘤模型，肿瘤研究可使用如PDX，类器官等人源化模型加强数据质量，另外，这种科技文章一般都需要解决问题才能完成闭环。
图8. 靶向OGT及CDK可抑制GBM生长
综上所述，这篇文章讲述了代谢酶CGT通过CDK5增强了脂质代谢酶ACSS2的S267磷酸化，稳定了ACSS2的蛋白水平，进一步促进胶质母细胞瘤中脂质代谢，从而促进胶质母细胞瘤的生长。文章立足于肿瘤代谢这一热点话题，描述了肿瘤代谢酶促进肿瘤生长的机制，具有较严密的逻辑性，所以可发表在肿瘤学高水平杂志Oncogene上。
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