浙江大学：高效表达外源蛋白的转染方法之探索

近日，浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杜爱芳、吴飞等作者在《浙江大学学报（农业与生命科学版）》第48卷第1期发文《绵羊成纤维细胞OAR-L1高效转染方法的探索》。文章揭示了慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式，研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

【作者及单位】

吴飞, 吴杰, 陈学秋, 周静茹, 张惠, 黄艳, 时恒枝, 杨怡, 马光旭, 杜爱芳*

(浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所，杭州 310058)

【基金资助】

国家重点研发计划（2017YFD0501203）；国家自然科学基金（32002304）；浙江省公益技术研究计

【通信作者简介】

杜爱芳，博士，教授, 兽医学一级学科负责人。曾兼任教育部高等学校动物医学教学指导委员会委员；国务院学位办第四届兽医专业学位研究生教育指导委员会委员；中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会常务理事；浙江省动物预防医学重点实验室主任。主要从事动物寄生虫病学、兽医公共卫生学及寄生虫分子免疫学等方面的教学和研究工作。先后主持承担“十三五”国家重点研发计划课题、国家自然科学基金项目（5项）、“973”课题、“863”课题、公益性行业(农业)科研专项课题、浙江省重大专项、省自然科学基金、重大横向等研究课题30多项。在国内外学术期刊发表学术论文200余篇，其中以一作或通信作者发表SCI论文80多篇。获浙江省科学技术进步奖二等奖1项，三等奖4项。主编、副主编、参编国内专著、教材6部。授权国家发明专利11件。

【第一作者简介】

吴飞，博士，主要从事动物寄生虫病学、寄生虫分子病理生物学和寄生虫分子免疫学研究。相关研究成果以第一/共同第一作者身份在International Journal for Parasitology和Vector-borne and zoonotic diseases等国内外期刊上发表，共5篇。

中文摘要

为了在绵羊肺成纤维细胞OAR-L1中高效表达外源蛋白，探索适合该细胞的转染方法，本研究比较了聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）、脂质体2000转染试剂（LipofectamineTM 2000 transfection reagent, Lipo 2000）、成纤维细胞转染试剂盒（CytofectTM fibroblast transfection kit, CF2）以及慢病毒介导的细胞转染方法在OAR-L1细胞中表达外源蛋白的效果。结果显示：以pLentiCMV-EGFP-Puro或pLentiCMV-mCherry-Puro荧光质粒转染OAR-L1细胞时，细胞密度和转染试剂用量均可影响PEI、Lipo 2000和CF2介导的细胞转染效率，且三者最佳转染效率均不超过30%，而慢病毒介导的细胞侵染不受细胞密度和病毒液用量的限制，获得的荧光细胞数目也显著高于前三者。包装好的病毒液可以在4或－80 ℃条件下至少保存15 d而侵染效果不受影响。在OAR-L1细胞中共表达2种外源蛋白时，包装获得的2种慢病毒液等比例混合后再侵染的方式能获得更高的共转率。综上所述，慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式，本研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

关键词

成纤维细胞OAR-L1 ; 转染方法 ; 慢病毒 ; 绵羊

本文引用格式

吴飞, 吴杰, 陈学秋, 周静茹, 张惠, 黄艳, 时恒枝, 杨怡, 马光旭, 杜爱芳. 绵羊成纤维细胞OAR-L1高效转染方法的探索. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2022, 48(1): 96-105. doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2021.01.192

WU Fei, WU Jie, CHEN Xueqiu, ZHOU Jingru, ZHANG Hui, HUANG Yan, SHI Hengzhi, YANG Yi, MA Guangxu, DU Aifang. Exploration of high-efficiency transfection methods for sheep fibroblasts OAR-L1. Journal of Zhejiang University（Agriculture & Life Sciences）[J]. 2022, 48(1): 96-105.

精要导读

细胞系（cell line）通常指能够连续传代的细胞，其易于传代和编辑的特性使得其在生物学研究尤其是在探究癌症发生发展机制及治疗方案中具有重要的地位。然而，广泛应用的绵羊细胞系仍十分匮乏，国内易获得的主要包括绵羊肺成纤维细胞（OAR-L1）和迪庆绵羊皮肤成纤维细胞（DQSHS1），前者是由中国科学院昆明细胞库于1990年从雌性绵羊的肺组织中建立的细胞系，呈纤维状，贴壁生长，2～3 d以1∶3的比例传代，生长迅速，连续传代后形态结构稳定，非常适合做细胞模型。目前，在基于绵羊细胞的研究中，仍主要依赖于原代细胞的分离培养，鲜有将现有绵羊细胞系应用于研究中的报道。同时，对绵羊细胞系或原代细胞高效转染方法的探索也十分有限，缺乏可推广的普适性结论。因此，寻找一种能够简单、便捷地对绵羊细胞进行稳定高效转染的方法十分重要。

真核细胞转染技术是研究细胞内基因及蛋白质功能的一种重要手段，普遍应用于细胞生物学、免疫学和病原学等众多学科的多个领域中，主要可分为物理学、化学和生物学方法。每种方法都有其独特的优势和劣势，如电穿孔法、显微注射法、基因枪粒子轰击法和激光转染技术等物理学方法能够实现精准打靶，但这类方法不仅需要特定的高精度仪器和专业的培训，而且通常操作的细胞数量有限或受转染细胞死亡率过高。因此，这类方法在基于反刍动物细胞研究过程中的应用有限。目前，应用最为广泛的仍是化学转染方法，其中最常用的是脂质体2000转染试剂（LipofectamineTM 2000 transfection reagent, Lipo 2000）、聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）及其类似的产品，其在原代绵羊细胞中转染效果最好，但效率均未超过30%。另外，成纤维细胞转染试剂盒（CytofectTM fibroblast transfection kit, CF2）因具有显著提高原代成纤维细胞转染效率的能力，亦受到部分学者关注，但其是否能高效转染绵羊成纤维细胞系仍需要进一步探索。至于生物学方法，目前应用更多的仍是慢病毒，首先是因为这类病毒存在缺陷，在侵染了一代细胞后不会在受侵染的细胞中再次包装新的病毒；其次是这类方法在细胞转染效率上具有显著的优势，甚至能够有效侵染多种公认的难转染细胞系或原代细胞。但这类方法在基于绵羊细胞的研究中，主要用于构建过表达或敲降细胞株，鲜有将之用作普通转染方法的报道。

基于此，本研究拟使用PEI、Lipo 2000、CF2和慢病毒侵染的方法，对OAR-L1细胞进行转染效果的比较，以寻找能够快捷、高效转染OAR-L1细胞的方法，为后续基于绵羊细胞的研究奠定理论基础和提供技术支撑。

部分图表

结论

本研究通过比较PEI、Lipo 2000、CF2以及慢病毒介导的4种转染方法在OAR-L1细胞中的转染效果，确定慢病毒侵染的方式比其他3种方法更高效地在该细胞内表达了外源蛋白。此外，分开包装再共同侵染的方式能获得更高的共转率，而插入的目的基因会降低共转效率且这种降低程度与插入基因自身特性相关联。综上所述，慢病毒介导的转染方法能够在难转染细胞中实现较高的转染效率，为后续基于OAR-L1细胞对绵羊甚至其他反刍动物展开相关研究奠定基础，同时，也能够为探索其他难转染细胞的转染方法提供参考。

本文转自“浙大学报农业与生命科学版”

如有侵权，请联系本站删除！