基因沉默之siRNA转染方法浅谈

siRNA隶属于基因沉默中的RNAi系列，能够迅速下调目的基因的表达水平。siRNA转染操作简单，周期短，是较为常用的基因沉默方式。今天我们来聊聊siRNA转染的实验步骤。

（1）     明确需要沉默的目的基因。

（2）     获得siRNA序列，可通过文献查找，自行设计，或交由公司设计。

（3）     公司合成siRNA。如果有明确的序列，可合成指定序列（包括对照和目的siRNA）,如果购买的是合成套餐（包括序列设计，对照和siRNA，转染试剂）。两种方式价格略有差异，具体咨询相关公司。

（4）     选择适宜的转染试剂，根据实验室经费情况，选择进口或者国产试剂。准备好siRNA和转染试剂后，就能着手转染操作了。

（5）     细胞接种：以六孔板为例，接种50000-10000细胞，2mL培养基，建议每次接种固定细胞数，保证实验稳定性。

（6）     24小时后，吸弃旧培养基，加入含10%FBS不含双抗的培养基（细胞在脂质体转染时通透性增强，抗生素的进入可能会对细胞状态产生影响），培养基加入量可进行条件摸索，个人使用的是750μL。

（7）     配制试剂：这里以六孔板转染3个对照，3个实验孔为例。准备一个1.5mL EP管，管壁标注lipo，加入Opti-MEM Medium（推荐使用，没有的话普通培养基也可以）150μL，加入9μL Lipofectamine® RNAiMAX Reagent。

（8）     准备两个1.5mL EP管，分别标注NC,Target，加入75μLOpti-MEM Medium，每管分别加入1.5μL siRNA(10μM) ，混匀。

（9）     向NC,Target管分别加入75μL lip管中溶液，常温放置5分钟。

（10）  分别取NC,Target管中混合液加入六孔板中，每孔加入50μL ，混匀，放入培养箱。

（11）  脂质体对细胞有毒性作用，最好更换培养基，有人在4-6小时更换，也有人12小时更换，可根据实际情况酌情处理，但应注意，每次更换培养基时间固定，保证实验条件一致性。

（12）  通常24小时基因表达，48小时蛋白表达，根据需要检测相应指标。

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