汇总 ▎细胞凋亡概念及检测方法。

细胞凋亡概念及检测方法

细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或者程序性的细胞死亡方式，是细胞受到特定基因调控后的主动性死亡过程，也是正常的细胞生理应答反应，凋亡的细胞最终将被体内吞噬细胞处理。过度的细胞凋亡将直接导致组织器官功能的下降；而对于癌细胞来说，凋亡过程中断则意味着癌症的发展和扩散。

1、细胞凋亡的形态学变化

通常可分为3个阶段。第1阶段是细胞的间接触消失，但是胞膜尚完整，粗面内质网上的核糖体脱落，细胞核出现固缩表现，本阶段持续时间很短；第2阶段是细胞核碎裂后与细胞内的各种细胞器结合，并进一步被质膜包裹形成凋亡小体；第3阶段是吞噬细胞吞噬凋亡小体，并将其消化为重新供机体使用。

2、细胞凋亡的机制

（1）细胞凋亡的死亡受体途径及调控：死亡因子受体(Fas)/死亡因子Fas配体( FasL)死亡通路 ；TNFR 死亡通路。

（2）线粒体途径及调控。

（3）内质网通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。

（4）端粒酶途径的细胞凋亡。

（5）NO参与的细胞凋亡反应。

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3、 凋亡检测方法汇总

3.1 光学显微镜

染色细胞：常用HE染色或Giemsa染色等。凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。镜下可见凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。本方法仅用于调亡现象的初步观察，重复性较差，对于凋亡不明显的情况判定效果一般。

未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

3.2 荧光显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst 是与DNA 特异结合的活性染料。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

（来自网络，仅交流学习使用）

染色后细胞核形态可大致分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

3.3 透射电镜

电子显微镜是观察细胞形态最好的方法，细胞核和细胞器的结构清晰易辨。凋亡细胞染色质固缩并凝结成块，聚集在核膜周边呈新月状或环状小体，细胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成一个个空泡，线粒体结构无明显改变。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。坏死细胞的染色质稀疏呈细颗粒状，分布无规律，边界不清，细胞浆肿胀，细胞器结构破坏，细胞膜不完整。

透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

（来自网络，仅交流学习使用）

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结果判断：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

3.4 Annexin V 联合PI法

（来自网络，仅交流学习使用）

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在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏，更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。但是同时需注意的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

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结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-／PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+／PH+)：而右下象限为凋亡细胞，显(FITC+／PI-)。

3.5、线粒体膜势能的检测

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线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位（Δψm）的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA 断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、DiOC6、JC-1、TMRM等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。

3.6、DNA Ladder法

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细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质 DNA 在核小体单位之间的连接处断裂，形成 50~300 kbp 长的 DNA 大片段，或 180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。

此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测，是凋亡的特征。由于该技术只能提供细胞死亡的定性分析，一般要结合定量的方法以确定样品的凋亡程度。另有需注意的重要之处，一些细胞类型或细胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡时不是以此种方式断裂DNA，另外在坏死细胞中也不发生这样的DNA裂解。这不是凋亡细胞的限定性试验，但不论在何系统中，这都是确定细胞死亡有用的特性。

此外，DNA Ladder法对于较多细胞出现凋亡的情况较为敏感，但是对于凋亡细胞比例很小的情况则不敏感。

3.7 连接介导的PCR检测

当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如临床组织活检）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。然而CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR）,连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。

3.8 流式细胞术检测凋亡细胞DNA含量

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细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即apoptotic peak）,代表凋亡细胞。根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。

3.9 TUNEL法

细胞凋亡中，染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端，TUNEL系统通过应用重组末端脱氧核苷酸转移酶（rTdT酶）在DNA的3´-羟基（3´-OH）末端催化掺入荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷（fluorescein-12-dUTP）来测量凋亡细胞的断裂的DNA。rTdT应用TUNEL（TdT介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法，TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）原理形成一个多聚尾(16)。然后，荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。用荧光显微镜在红色或蓝色背景下（分别是碘化丙啶或DAPI）检测定位，凋亡细胞的绿色荧光（荧光素-12-dUTP）。

此法应用广泛，适用于石蜡组织切片、冰冻切片以及细胞培养物等等。检测灵敏，但其自发荧光是需要注意的地方。

3.10 mRNA和蛋白检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用。对于凋亡而言，最有价值的基因和蛋白就是Caspase3（32KD），因为Caspase3是几乎所有凋亡信号通路的“终点”，其基因蛋白的表达水平是评价凋亡的重要指标。此外一定要检测Caspase3蛋白的剪切后活化体（17KD、12KD），即cleaved-Caspase3蛋白的表达水平，只有活化了的Caspase3才有功能。

此法是目前应用较为广泛的方法，毕竟PCR和Western blot可是咱们的看家本领啊。

3.11 细胞色素C的检测

细胞色素C在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，细胞色素C暂存于线粒体膜间隙之中，胞浆中没有。一旦Bax/Bcl-2蛋白的比例发生改变，细胞色素C就会释放到胞浆中，并进一步激活Caspase9，引起凋亡级联反应。

在早期，有一部分研究人员对细胞色素C尤其关注，近年使用的较少。值得注意的是采用此法，必须将胞浆和线粒体中细胞色素C区分开来研究，否则很难说清楚，因此组织或细胞培养物匀浆后差速离心必不可少。

3.12 Telemerase Detection (端粒酶检测)

研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性，而正常体细胞是没有端粒酶活性的。

Intergen公司提供的一款试剂盒，名叫TRAP-eze Telemerase Detection Kit。它提供特定的寡核苷酸底物，能够分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象。

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