2022/3/21 10:27:32 阅读：264 发布者：chichi77
以下文章来源于科研讲坛 ，作者大师姐之前跟大家分享完铁死亡相关的高分文章解读，今天给大家解读一篇与干细胞相关的经典高分文章（Mol Cancer，IF=27.401），题为：LncRNA PKMYT1AR promotes cancer stem cell maintenance in non-small cell lung cancer via activating Wnt signaling pathway。
研究背景
肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤中具有极强的自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的一类细胞。肿瘤细胞最早发生于体干细胞，体干细胞与CSC均具有无限增殖等相似的生物学特性，体干细胞只需突变获得过度增殖能力，即可转化成肿瘤。我们经常听到的肿瘤干性也就是CSC的特性：
1、极强的致瘤能力，这个特性是肿瘤发生、发展和维持的基础；
2、自我更新并多向分化，所谓的多向分化也就是在一定的条件下可以分化成多种异质性的肿瘤细胞，例如，在临床上经常见到的，前列腺瘤在雄性激素治疗后可变成小细胞癌、鳞癌、肉瘤癌等等。由于CSC的特性，多项研究结果一致发现：癌转移与CSC、肿瘤微环境变化密切相关。
图源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7426526/
研究内容
这篇研究的LncRNA PKMYT1AR调控非小细胞肺癌进展，及如何维持肿瘤干性的文章。研究内容涉及ceRNA调控机制、明星转录因子（YY1）、明星通路（WNT通路）、泛素化降解及肿瘤干性等多种热点，是一篇研究机理与临床治疗应用相结合的文章。
第一步：确定研究分子
首先还是开始挖掘数据及细胞系、组织样本中实验验证，结果发现， PKMYT1AR无论是在癌症干细胞、顺铂耐药细胞系还是非小细胞肺癌组织中均显著上调表达，且在干细胞中及化疗耐药中上调更加明显；
为了进一步探索LncRNA PKMYT1AR在临床特征，通过生存曲线及ROC曲线分析发现，该分子与预后显著相关；其次，为了确定该分子是否为非编码类及可能涉及的调控机制，通过WB验证发现该分子无法翻译成蛋白且亚细胞定位分析发现位于细胞质中。
得咧，这下明确了,结合分子大小总算确定该分子为LncRNA及位于细胞质中，那最能想到的那就是ceRNA机制咯。
引起关注了哈，开始搞事业啦。。。啦啦啦啦。。
图1
第二步、细胞、动物功能实验验证
细胞实验：
来个全面的：增殖、侵袭转移及细胞周期都来一波。
作者先通过GSEA分析PKMYT1AR相关的信号通路，结果发现：绝大多数为细胞周期及上皮-间质转化（EMT）通路相关。
既然预测是这样，那就通过细胞实验来验证验证咯。首先，以A549和SPC-A1细胞为对象，慢病毒shRNA敲除实验结合回补实验验证了：PKMYT1AR的敲除抑制细胞增殖；其次，流式细胞术进行细胞周期实验结合WB实验发现：PKMYT1AR的敲除导致G0/G1期细胞数量的积累及相关细胞周期关键调控因子发生异常表达。最后，通过划痕实验、Transwell实验及western blot验证EMT标记物，结果发现：PKMYT1AR敲除细胞的肿瘤细胞迁移能力明显受到抑制且EMT相关标记物也异常表达。
因此，得出结论：上述实验证明了PKMYT1AR在非小细胞肺癌中的致癌作用。
为什么这种好事不来找找我？？？动物细胞实验啊，我待你如祖宗，你就是不给我出表型，难啊，一切尽在不言中。。。。。
第三步：PKMYT1AR的上下游调控机制
要研究，那就顺便来个全套：上至转录因子下至调控通路。
上游转录因子预测及验证：
首先，作者通过UCSC数据库预测PKMYT1AR的上游调控因子（转录因子）并结合JASPAR数据库预测结合位点，初步确定YY1为该LncRNA的转录因子；其次，通过样本表达量验证、生存预后、YY1与PKMYT1AR的相关性分析及YY1的敲低实验中均证明了YY1为PKMYT1AR的转录因子且与肿瘤进展相关。
下游调控机制预测及验证：
（1）确定相互作用的miRNA：
先通过StarBase预测miRNA，再通过分析miRNA与PKMYT1AR的表达相关性、miRNA生存预后分析及miRNA的过表达实验是否会影响PKMYT1AR的表达，接着，荧光素酶实验验证PKMYT1AR和miR-485-5p之间的结合关系。上述的研究初步确定：在NSCLC中PKMYT1AR和miR-485-5p之间存在特异性关联。
细胞功能验证：miR-485-5p在细胞中的过表达/敲除实验发现：miR-485-5p影响细胞的增殖、侵袭和转移。其次，发现，miR-485-5p抑制剂过表达可以克服PKMYT1AR敲低引起的细胞增殖、集落形成和肿瘤细胞迁移能力下降。
结论：上述实验支持了PKMYT1AR/ miR-485-5p轴的特异性作用。
（2）确定miRNA的下游靶点基因及验证：
根据ceRNA调控机制，LncRNA\mRNA与miRNA的表达呈负相关。根据这个特点，作者通过数据集分析、相关性分析、生存预后及ROC曲线分析，筛选miRNA相互作用的靶点基因：初步确定PKMYT1为miR-485-5p主要的靶点基因；
最后，细胞过表达/敲除实验、荧光素酶报告分析及WB验证，最终证明了：在NSCLC中，PKMYT1为miR-485-5p的作用靶点基因。
（3）确定LncRNA PKMYT1AR 与PKMYT1的特异性关系
首先，免疫组化验证PKMYT1在NSCLC中蛋白表达水平；过表达/敲低实验验证PKMYT1对细胞增殖、侵袭转移的影响；拯救实验验证PKMYT1AR/PKMYT1轴的特异性。所有实验证明了：PKMYT1与肿瘤进展相关且强制表达可以克服PKMYTAR敲低导致的细胞效应。
结论：最终确定了调控轴：PKMYT1AR/ miR-485-5p/PKMYT1。
第四步：PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1轴维持非小细胞肺癌肿瘤干性
首先，分析PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1与NSCLC肿瘤干细胞标记物的相关性，初步确定：PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1可能与肿瘤干细胞特性相关；其次，基于CSC对化疗/放疗的耐药性现象，作者对其进行细胞活力及照射敏感性实验，结果发现：与对照组相比，DDP和Gy x射线照射处理后的存活细胞更少，PKMYT1AR或PKMYT1敲除后的细胞凋亡数量增加，对凋亡相关标记物检测也证明了以上的结论。
随后，异种移植瘤形成实验也证明了：PKMYT1AR抑制使体内对DDP反应的肿瘤细胞敏感，而PKMYT1强制表达可以逆转PKMYT1AR的敲低效应。
结论：PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1轴在体内非小细胞肺癌进展中的特定作用。
接着，在肿瘤干（样）细胞中敲低PKMYT1AR/PKMYT1后，分析干细胞标记物的蛋白和mENA表达水平，发现表达显著降低；其次，通过敲低PKMYT1AR/PKMYT1，而过表达miR-485-5p，则抑制肿瘤球的形成能力；结论：上述实验充分证明了PKMYT1AR/miR-485-5p/PKMYT1 在非小细胞肺癌干细胞中的特异性作用。
第五步：证明PKMYT1通过稳定β-catenin蛋白激活Wnt信号通路
先通过KEGG分析和共表达分析，初步确定PKMYT1与WNT通路显著相关；由于阻断GSK-3β介导的β-catenin磷酸化可促使Wn通路激活，因此，作者通过免疫印迹检测PKMYT1缺失细胞中β-catenin蛋白的磷酸化模式和稳定性，结果发现：β-catenin蛋白在细胞质和细胞核中都显著减少，而蛋白酶体抑制剂MG132的作用逆转了这一现象；
最后对β-catenin蛋白的降解速率实验证明：PKMYT1的缺失加速了A549和SPC-A1细胞中β-catenin的降解。通过免疫共沉淀实验发现：内源性和外源性β-catenin分别与PKMYT1或β-TrCP1结合，而外源性β-catenin/β-TrCP1复合物的形成被PKMYT1过表达以剂量依赖的方式消除。
结论：PKMYT1通过阻断e3连接酶SCFβ-TrCP与β-catenin的结合，减少了β-catenin的降解，导致Wnt信号的激活和肿瘤干细胞的自我更新。
好啦，今天就解读到这，有兴趣的可以自个去pubmed上搜索原文阅读哦。
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