2022/3/17 17:21:44 阅读：303 发布者：chichi77
WB 实验常常让人头疼，不是没结果就是趋势不对，即使做了很多优化调整，结果却仍不尽人意。这是因为我们的关注点往往是 WB 步骤有没有出错，而从来没有部署过 WB 的全局。其实做 WB 前，我们需要做一次 WB 设计！没错，临床试验需要设计，WB 也需要设计，只有把整体的实验设想进行合理地规划才能获得最佳的实验结果。那如何做 WB 设计呢？
第一件要做的事情就是知己知彼！
一
了解你的目标蛋白
我们首先需要收集目标蛋白以下信息：
1. 目标蛋白的名字
2. 目标蛋白在哪些组织中表达，是否具有特异性
3. 目标蛋白的分子量
4. 目标蛋白在细胞中的表达位置及表达量
5. 是否有相应的抗体
如何获取这些信息呢？除查询文献外我们可以借助生物信息学方法及一些产品信息获取相关信息。例如使用 Uniport，维基百科，NCBI，ExPASy 等进行查询。还可以通过相应抗体产品提供的信息进行查询。
了解了目标蛋白以上内容后，我们就可以开始做 WB 设计啦！
二
WB 方案设计
1. 首先明确实验目的，为什么要做这个 WB 实验？要验证哪些问题？
例如：是想验证目标蛋白的表达情况？还是要验证目标蛋白在细胞几个不同组分中表达差异？或者是进行蛋白定位、蛋白转运过程的研究？
2. 明确好实验目的后，根据样品种类，目标蛋白表达量及细胞定位情况，确定蛋白提取方案。
例如：
* 目标蛋白表达量正常，但小分子量蛋白或是膜蛋白这类目标蛋白很难提取，使用常用的 RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂解液进行提取时，容易丢失在 RIPA 不可溶组分中，如果样品又是研磨困难的组织样品，则优先选择对膜蛋白和小分子量蛋白提取效率更高且不需要匀浆仪的 Invent 柱式法工具进行总蛋白提取[1]。
* 目标蛋白在某个特定细胞器上（内质网，高尔基体，溶酶体，线粒体，内体等）表达，且蛋白表达量较低，若用总蛋白检测时条带较弱，则推荐使用 Invent 柱式法工具富集特定细胞器蛋白后再检测，提高检出效率。
* 研究蛋白定位或研究蛋白转运过程，推荐使用 Invent 柱式法工具进行细胞组分分离，将样品分离为不同组分如分成细胞核，细胞浆，细胞器，细胞膜组分等。
3. 根据实验目的，目标蛋白分子量及蛋白定位，设计合理的对照及上样顺序，并选择合适的内参，确认上样量。
例如：验证目标蛋白在胞质胞核中易位的情况，首先将样品进行胞质和胞核蛋白分离，可设定总蛋白为对照组，胞质与胞核蛋白样品应同时上样到一块胶中保证 WB 所有条件一致，才可说明蛋白表达量的差异和趋势，若在不同胶中，孵育曝光等条件无法统一，得出的结论会导致偏差。
内参选择的方向可以考虑以下四点：
1）确认样本种属来源：是哺乳动物还是植物还是其他
2）分子量大小需要与目的蛋白差 5 KD 以上
3）内参蛋白与目标蛋白之间不能有调节作用
4）如需验证与蛋白定位相关的结论，要根据蛋白表达位置选择相对应的内参（如图 1，图 2）
图 1：常用各组分内参参考（动物样品）
（内容来源：英文特）
图 2 ：常用各组分内参参考（植物样品）
（内容来源：英文特）
图 3：应用实例[2]
本文中为验证 TNF-ɑ 刺激后 NF-ĸB p65 蛋白的核易位情况，设置过表达 circ-Sirt1 组和敲低 circ-Sirt1 两组样品，首先使用 Invent 柱式法胞质胞核分离试剂盒将样品分为胞浆蛋白和胞核蛋白，每组按照胞浆组分，胞核组分顺序分别上样，使用 GAPDH 作为胞浆内参，LaminA/C 作为胞核内参，验证胞质胞核分离成功无交叉污染。检测目标蛋白 NF-ĸB p65，验证了过表达 circ-Sirt1 的血管平滑肌细胞（VSMCs）中，TNF-ɑ 诱导的 NF-ĸB p65 的核易位被显著抑制，并伴有促炎细胞因子和黏附分子表达减少（图 E）。相反，敲低内源性 circ-Sirt1 增强了 TNF-ɑ 诱导的 NF-ĸB p65 的核易位（图 F）。
4. 根据目标蛋白的分子量大小确定 SDS-PAGE 凝胶浓度及使用蛋白 Marker的分子量范围，转膜方案等。
凝胶的选择：分离胶浓度的选择主要取决于目的蛋白的分子量大小，可参考以下表格。
表一：不同浓度分离胶的最佳分离范围
（数据来源：英文特）
5. 进行预实验
预实验非常有必要，不要认为预实验浪费时间，更不要误解预实验是全部实验的压缩版。预实验的主要目的并不是得出什么结论，而是熟练实验方法，检验各类试剂与试剂盒的工作状态，为进一步优化打基础。预实验时需要认真阅读各类操作说明书，使用普通样品或少量样品进行条件摸索，记录结果和问题。优化方案时，每次只改变一个变量，对比优化结果和优化前的差别，修改实验设计至达到最佳实验效果。
到此 WB 方案设计完成，实验的整体思路已经非常明确了。做好 WB 整体设计是 WB 成功的开始！当然 WB 的成功还离不开严谨的实验操作和高质量的蛋白样品，只有选择适当的蛋白样品制备方式，才能锁定最终的成功。Invent 离心管柱法系列蛋白快速提取和亚细胞结构分离工具，可提高蛋白的溶解效率，减少蛋白丢失，有效提高蛋白样品质量，是 WB 成功必不可少的利器！点击阅读原文了解「RIPA 不是万能的」！
内容审核：王东方、周育红
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1]. 1.Li. Q. (2016) Pitfalls of protein extraction by RIPA buffer. BioTechniques, Vol. 61, No. 6, December 2016, p. 327
[2]. Kong, P., Yu, Y., Wang, L., Dou, Y. Q., Zhang, X. H., Cui, Y., ... & Cui, W. (2019). circ-Sirt1 controls NF-κB activation via sequence-specific interaction and enhancement of SIRT1 expression by binding to miR-132/212 in vascular smooth muscle cells. Nucleic Acids Research.Doi: 10.1093/nar/gkz141
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