背景介绍
BACKGROUND INTRODUCTION
Western Blot 实验相信是很多生物科研小伙伴的常做实验，抱着一颗想要做出一张完美漂亮WB图的小小心愿，最后显影可能还是一场空的辛酸血泪史，操作流程看似简单，但是却环环相扣，抗体选择，试剂选择每一步没有做好，可能都会使我们的愿望化为泡影，今天小编就来整理一下WB实验整体的实验流程。
蛋白质印迹(Western blotting)：又称为免疫印迹，根据抗原抗体的特异性结合，半定量检测样品中的某种蛋白的方法。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析条带的位置和条带深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况。
图1. WB实验原理图
实验流程
实验流程介绍
样本制备蛋白提取
1. 前期准备：首先要了解你所研究蛋白的内源表达水平，常用的数据库如Uniport、Atlas、BioGPS，或查阅相关文献。设置阳性对照，选择内参蛋白，是在各个组分中表达量几乎不变的看家基因，最常用的是GAPDH和β-actin。
2. 蛋白提取：是Western Blotting 的第一步，要求选择样本新鲜，降低背景，避免反复冻融，选择合适的裂解液裂解样本，选择合适的蛋白酶或磷酸酶抑制剂，防止蛋白的降解和磷酸化信号的丢失。推荐使用商业化的混合型抑制剂，可抑制大多数的蛋白酶。
大致处理方式如下表：具体步骤请参考试剂盒的说明书。
裂解液的选择：可参考下表
裂解能力: SDS>脱氧胆酸钠> Triton X-100>NP40
蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度测定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法，常用的是BCA法，基本原理是在碱性条件下，蛋白将Cu+ +还原为Cu+，Cu+ 与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
之后加入Loading buffer，含有变性剂，使蛋白质变性，释放二硫键，最后煮沸变性保存样品于-20℃或-80℃。
上样和电泳
1. 制备凝胶：根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶，配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。
参照表格如下：
配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中，不要太满，小心打入气泡。待分离胶凝固之后加入适当剂量的无菌水封胶，吸水纸吸干水分加入浓缩胶立即缓慢插入梳子。
2.上样：蛋白Marker孔加入5-10μL，多选择生物素化蛋白Marker，其余蛋白总上样量20-50μg，组织样本稍多些上样，尽量保持每个泳道的上样量一致，空泳道用Loading buffer补齐。
3. 电泳：接上电源后，先用80V恒压电泳浓缩至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压100v--120v直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5h。
转膜
1.膜的选择：广泛使用的是NC膜和PVDF膜
2.转膜
转膜的方法包括湿转、半干转、干转，湿转是转膜最完全且应用最广泛的方法，但是所需时间较长。
转膜时间参考下表：
封闭和抗体孵育
1.封闭：目的是为了减少膜对一二抗的非特异吸附，降低背景。将NC膜从湿转系统中取出，并用TBST润洗2次，每次5 min，然后进行封闭。
化学发光法：用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡NC膜，室温摇床封闭1-2h；
荧光法：含5% 脱脂奶粉的TBS，脱脂奶粉需选择实验室级别的。
最后再用TBST润洗封闭后的NC膜3次，每次5 min。
2.抗体孵育
一抗能识别膜上不同种属的蛋白，买经过验证的，二抗上带有发光底物，只能识别一抗。
不同偶联的二抗选择参考下表：
稀释一抗，膜与一抗4℃孵育过夜，充分洗涤，稀释二抗，膜浸泡于二抗孵育液中，可以选择HRP或荧光标记的二抗，室温孵育1h，充分洗涤后检测。
显色曝光
最常用的是化学发光，抗体上偶联的HRP催化ECL发光底物显色，取出洗涤的膜后，用滤纸吸干水分，放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。
转自：“Super Lab”微信公众号
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