RT-qPCR检测的一步法与两步法优缺点

RT-qPCR检测

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR的一步法与两步法

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

图1.一步法与两步法RT-qPCR

一步法

优点：

1. 由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差；

2. 更少的移液步骤能够减少污染的风险；

3. 适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高。

缺点：

1. 无法分别对两步反应进行优化；

2. 由于反应条件是结合两步反应折中得到的，因此灵敏性不如两步法；

3. 单一样品检测的靶点数较少。

两步法

优点：

1.能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库；

2. 靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增，而不需要多重cDNA库；

3.能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件；

4. 灵活的引发条件选择。

缺点：

1. 使用多个试管，以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险，并且耗时；

2. 相较于一步法，需要进行更多的优化。

转自：“Super Lab”微信公众号

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