[实验技能]CCK-8实验最全操作步骤

CCK-8是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的细胞生物学实验。CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。细胞增殖越多越快，细胞颜色越深，证明毒性小；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数，目呈线性关系。

 实验材料及试剂

细胞，96孔细胞培养板、CO2培养箱、酒精灯、微量移液器、酶标仪、CCK-8试剂盒等。

实验步骤

1. 取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，每孔100ul加入96孔细胞培养板中。通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul （具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定)。如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，如果是悬浮细胞，不需要预培养。

2. 根据实验需求，在培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时间。如果是做细胞毒性试验，加入毒性物质后的培养时间需要摸索。要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要1-2代以上的时间。

3. 取10ul CCK-8溶液加入96孔细胞培养板，在37℃培养箱中继续孵育0.5-4小时。

4. 测定吸光度。建议采用双波长进行测定，检测波长430-490nm，参比波长600-650nm，或者采用450nm单波长检测。

计算公式细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物)

注意事项

1. 如果细胞起始的培养体积为200ul，则需加入20ul的CCK-8溶液，以此类推。

2. 建议每个药物浓度孔设置3个复孔，最后取均值做曲线。

3. 设计好实验对照，尽量排除其它因素的干扰：

1）空白对照：可以用加了等量细胞培养液、CCK-8溶液和药物但没有加细胞的孔；

2）阴性对照：不加药物但加了药物溶剂的细胞孔。

4. 试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可能会干扰检测，需设法去除（加入CCK-8溶液之前更换新鲜培养基，去掉药物影响。如果药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可）。

5. 加入CCK-8溶液后注意孵育时间，孵育时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6. 细胞在培养箱内培养时，培养板最外边的孔容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作测定孔用。

7. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液终止反应，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会变化太大，一般还是建议立刻检测。

8. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

本文来源于信诺金达生物科技

转自：“Super Lab”微信公众号

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