原代细胞织块培养法实验操作流程详解

原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。原代细胞培养是指将组织从动物体内取出，经各种酶、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法剪碎处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。细胞的分离纯化和细胞培养技术是细胞生物学实验的基础。我们通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞。原代细胞分离培养实验流程:

首先将组织从机体中取出，经胰蛋白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。

实验流程:

1. 取材：将目标动物麻醉或处死，动物体上取出目标器官或组织。

2. 原代细胞的分离：获取的组织或器官中含有血液和多种细胞，我们将获取的组织或器官在无菌环境下充分剪碎，消化，分散成单细胞。根据目标细胞的特点选择不同的筛选方法， 以获得目标细胞。

3. 培养和鉴定：根据客户的需求，尔丙生物将获得的高纯度原代细胞继续培养或进行传代培养，也可以冻存处理，满足不同的实验需求。

   常用的原代培养法有组织块培养法和消化培养法。许多实验室喜欢用组织块培养法进行原代培养，因为方法简单，细胞也较容易生长。尤其是培养心肌，有时还可观察到心肌组织块搏动。细胞从组织块边缘向外长出并铺满培养皿或培养瓶后， 即可进行传代。

下面介绍织块培养法：

1. 操作步骤

（1）、在无菌条件下，取待培养的组织适量，置入小烧杯中， 以适量Hanks 溶液清洗2~3 次，去掉组织块表面的血污。

（2）、用眼科剪将组织块反复剪成0.5~ 1mm3的小块。

（3）、再用Hanks 溶液反复漂洗， 直至液体不混浊为止。等组织块下沉，将烧杯倾斜，用小吸管尽量吸除Hanks 溶液。

（4）、用含20%灭活血清及双抗溶液(200U/ml 青霉素、200μg/ml 链霉素）的培养液再清洗，用吸管吸干后加入5ml 含20％血清的培养液。

（5）、用弯头吸管吸取组织小块，均匀地置于培养皿内表面，吸去多余的培养液，各组织小块之间相距0.5cm 为宜。盖好培养皿盖，做好标记， 置37°C 的CO2培养箱内。

（6）、2~4h 后，于超净工作台中，缓缓地向培养皿中加入上述含20％血清及双抗溶液( 100U/ml 青霉素及100μg/ml 链霉素）的培养液少量，以使组织块浸没在培养液中。

（7）、轻轻地将培养皿及组织块移至CO2 培养箱， 如无特殊情况，不必观察。1~2 周后，可观察到细胞从组织块边缘长出，形成生长晕。

（8）、 一般说来，若培养液无明显改变， 1 周换液1 次即可。待细胞长满整个培养皿内表面，即可进行传代培养。

2. 注意事项

（1）、如果是用培养瓶而不是培养皿，则接种组织块千培养瓶底壁后， 要轻轻地翻转培养瓶，令瓶底在上，盖好瓶盖后轻轻置入37°C 的CO2 培养箱， 2~4h 后，取出培养瓶，在超净工作台内打开瓶盖，仍令组织块在上方。在组织块对面瓶壁加入适量上述培养液。然后，轻轻翻转培养瓶，让组织块浸没于培养液中。盖好瓶盖后放回二氧化碳孵箱，继续培养。

（2）、从培养皿表面游离下来的组织块，弃去即可。

（3）、如果使用玻璃培养瓶，而不是新的塑料培养瓶，则最好在玻璃底表面包被大鼠鼠尾胶原，这样不但有利于组织块的黏附，而且可使细胞生长得更好。

（4）、本方法适于各种组织的培养，操作者还可根据自己的实验需要和细胞种类加以修改。

转自：“Super Lab”微信公众号

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