荧光定量PCR实验中对照类型介绍

qPCR从样本采集到结果检出有很多的步骤，包括样本采集、样本保存、样本处理、样本检测、数据分析等一系列环节，不同的环节可以选择不同的对照进行监测，对照总体可分为阴性对照与阳性对照两类：

阴性对照

实验中经常遇到无法判断反应孔中的扩增信号是样本真实扩增还是污染扩增的情况，这就需要阴性对照来作为对比。常见的阴性对照有以下几种：

●  无模板阴性对照(No Template Control, NTC)

NTC一般用纯化水代替，用以替代正常反应中的核酸样本，来监测反应体系中的污染情况。正常情况下，NTC样本不应扩增出信号，如果出现NTC孔扩增的情况，即预示反应体系可能存在污染。

●  无逆转录酶对照(No Reverse-Transcriptase Control，No RT)

No RT是指在进行逆转录实验中不加入逆转录酶，经过此过程的cDNA在后续qPCR过程中出现了荧光信号，则代表样本中含有未去除干净的基因组DNA。

●  阴性样本对照(Negative Sample Control, NSC)

NSC是指不含目的基因的样本，在经过前处理后进行qPCR扩增，如出现扩增信号，应结合NTC结果，分析是否处理过程中污染了阳性样本。

阳性对照

qPCR实验结束后，如反应孔出现无扩增或扩增Ct值很大的情况，在无法确认目的基因是否正常扩增时，阳性对照的正确选择可以避免错误的报告情况。

●  扩增对照(Amplification Control)

使用含有目的基因的质粒、假病毒或其基因组DNA作为扩增对照，监测PCR扩增体系是否正常。如出现Ct值偏差较大或无扩增，则表示反应体系存在问题。

●  阳性样本对照(Positive Sample Control, PCS)

通过对确认的样本阳性进行独立的提取操作，并完成后续PCR过程，以最终结果来判断实验方法的可靠性。

●  内部阳性对照(Internal Positive Control，IPC)

一般在核酸提取前向样本中加入定量的外源性核酸，最终以多重反应体系同时扩增目的片段与该外源基因，通过Ct值判断提取过程中的核酸回收效率。

●  内参基因(Endogenous Control)

往往是各组织和细胞中表达相对恒定的基因，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常见的内参基因有GAPDH、β- actin、18sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP等。参基因的选择可参考已发表文献或通过具体实验来筛选；也可通过内参基因数据库来检索，如中科院内参基因数据库（ICG http://icg.big.ac.cn/），里面涵盖了200多个物种的内参基因信息。

以上就是qPCR实验中常用的对照，灵活运用能够大大提高实验的效率，及时找出和分析实验失败的原因。

转自：“Super Lab”微信公众号

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