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蛋白Marker的作用
要了解蛋白Marker的作用，首先需要了解SDS-PAGE电泳分离蛋白的原理，在电泳中，分子量越小的蛋白遇到的阻力更小，移动得越快，跑到凝胶前沿；分子量越大的蛋白遇到的阻力更大，移动得更慢，留在凝胶的上端（注意这和分子筛层析原理不同）。为了确认目标蛋白的分子量，就需要一个参考组，让具有指示性的蛋白Marker与样品一起电泳，由于蛋白Marker分子是确定的，就可以通过目标蛋白位置与蛋白Marker比对，判断其分子量大小。
蛋白分子量标准，常称之为蛋白Marker。在免疫印迹（Western blotting）试验中，分子量Marker就像螺丝钉一样，虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用，其是判断目标蛋白分子量大小的标准。只有Marker精确无误了，实验结果才有说服力。除此之外，蛋白Marker还能够提示电泳是否正常，转膜是否成功等信息。
现有的蛋白Marker研发经历了普通Marker、预染Marker、曝光Marker 和荧光蛋白Marker四个发展阶段。
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普通蛋白Marker
普通蛋白Marker，或称之为未染色蛋白分子量标准，也叫预混（pre mixed）蛋白分子量Marker，是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是早期精确判断蛋白大小的必备产品。普通Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。
预混的Marker通常有一个或者几个条带加倍浓度作为区别，用于帮助判断每个条带的大小。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的，越近越好。普通Marker在电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才能显色，无法对实验过程起预示参照作用。
按照条带的分子量大小通常有三种：宽分子量蛋白Marker、高分子量蛋白Marker、低分子量蛋白Marker。从实验总体考虑的，应该选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的风险。不过，条带越多，价格可能也会越贵。
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预染蛋白Marker
预染蛋白分子量（prestained Marker），也叫预染Marker，是将普通蛋白Marker与多种染料共价偶联而成，在电泳过程中或者转膜时可以肉眼直接观察到的一种蛋白分子量Marker。预染Marker的出现给科研者带来了极大的方便，可以在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。
比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳。另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全。
之前判断转膜是否成功，一般采用丽春红染膜，考染胶和银染胶，但是费时费力，还无法直接准确指示转膜是否成功。预染Marker肉眼就可以观察转膜情况，方便快捷。但是预染蛋白Marker经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确，往往导致WB结果判断出现一些偏差，不太适合精确定位蛋白。再加上膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，预染蛋白Marker由于共价偶联了染料分子和非染色蛋白Marker在膜上的吸附能力是有差异的，就无法准确提示转膜情况。
预染Marker可以分为两种：单色预染和彩色预染。单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的，观察起来不是很方便。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色，更加方便记忆区分。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker转印膜上，所以需要的上样量相对少一些。如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”或者漂亮的单色Marker，往往需要比说明书里多加一些。
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曝光Marker
普通Marker和预染Marker还有一个缺点就是不能够在最终Western曝光的胶片或者扫描照片中显色。普通Marker在做Western时，需要在印迹前先用丽春红或者是SYPRO荧光蛋白染色液等不干扰Western Blot的染色方法显色，在胶上做标记最后才能"拼"在最后的结果中；
预染的Marker就要在转膜后标记膜，或者剪膜，最后再"拼上"。以上2种方法都需要将照片和膜进行比对来判断Western结果，容易出现偏差或者错误，为此，很多产品在向最终的显色做努力，出现了间接曝光Marker，曝光Marker，预混曝光Marker和预染曝光Marker四个发展阶段。
曝光Marker克服了使用常规预染 Marker评估蛋白转膜效率和目标蛋白信号时所存在的一些不足。
主要表现为：1、预染marker经过化学修饰后分子量在SDS-PAGE上表现的迁移率不一致；2、预染marker无法在X光胶片上显色，X光胶片上显色的条带需要与转移到膜上的预染 Marker比对才能确认蛋白的位置和大小，整个过程比较繁琐同时容易造成误差甚至是错误。3、最重要的是目的条带和曝光Marker出现在同一
中，而不是后期的拼接，让结果更真实可靠。
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间接曝光Marker
要是想直接将Marker结果显示在最后结果上，不用手工作图或者拼接，那就要Western专用的Marker了。
目前市面上已有的可用于曝光的蛋白marker，不同公司采用了不同的技术。CST公司 的曝光marker是纯化的蛋白与生物素共价偶联的混合物，抗生物素抗体-HRP或链霉亲和素--HRP在Western blot中用来检测生物素化蛋白Marker，最终使蛋白样品和蛋白marker 经化学发光检测后，能够同时在X光片上显示出来。BIORAD采用含有 Strep-标签的蛋白Marker，当使用 Strep-Tactin-HRP时可被化学发光检测最终显示在凝胶转印膜胶片或 CCD 图像中。此外，还有在蛋白Marker上添加His-tag，利用二抗添加His-tag抗体-HRP很容易将Marker条带显示在Western结果上。
以上方法的优点是Marker和目的蛋白对应性好，能同时显示在一张照片上，不用拼接，利于分析。缺点是如果样品中带有生物素或His类似结构，可能影响结果，而且反应体系需要额外添加试剂，增加步骤，导致过程太过复杂也会干扰实验结果。
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曝光Marker
蛋白Marker条带会和检测目标蛋白会一同出现在显色的
中，我们又称之为曝光Marker（Exposure Marker）。曝光Marker的原理是，每个条带蛋白都含有IgG结合位点，可以与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊以及兔子来源的IgG恒定区结合，因此在实验过程中这些蛋白Marker可以直接或间接地结合二抗，与目标蛋白信号同时在X胶片上曝光显色。由此可以更方便准确地判断实验样品信号的位置和大小。
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预混曝光Marker
仅仅含有可曝光的蛋白 marker无法判断转膜效率，需要另外加一道预染Marker，不仅繁琐而且占用泳道，减少了可电泳的样品数量。预混曝光Marker是将预染Marker和曝光Marker按一定比例混合在一起，既可以利用预染Marker判断转膜情况，又可以利用曝光Marker示踪目标蛋白信号及其位置。
缺点是预混曝光能够显示的蛋白分子量范围有限，无法准确判断目标蛋白信号的位置和大小。其原因是预混曝光Marker由7种不同分子量的蛋白组成（19、20、35、45、60、65、110KDa），其中19、45、65KDa条带为蓝色预染Marker，其他四个条带都可与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、兔等的IgG恒定区结合，可以直接或间接地结合二抗，与目标蛋白信号同时在X胶片上曝光显色，由此来判断目标蛋白信号的位置和大小。
但是3条预染Marker和4条曝光Marker数量太少，能够显示的蛋白分子量范围有限，导致无法准确判断目标蛋白信号的位置和大小。如果各自增加预染Marker和曝光Marker的条带数量，将增加试剂成本，并且泳道载样量有限，无法分离过多蛋白Marker条带。
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预染曝光Marker
有报道称根据预染曝光蛋白Marker中各蛋白条带分子量大小，将能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的抗体Fc区与骨架蛋白融合表达，然后将融合蛋白与活性染料雷玛素(remazol)共价偶联，从而实现同一蛋白即是曝光蛋白，又是预染蛋白的目的。其中无需加入额外的抗体，如抗生物素抗体-HRP或链酶亲和素-HRP等，就可结合来源于人、大鼠、小鼠、兔等物种的IgG或抗兔和小鼠的二抗，既能在电泳过程中和转膜后指示蛋白的大致位置，又能指示转膜效率；
此外，还能同目标蛋白显示在一张照片上而无需额外增加预染Marker泳道。此方法由于需要将曝光蛋白Marker染色，依然会出现预染蛋白Marker的问题：经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确；与膜的吸附能力发生变化，无法准确提示转膜情况。
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荧光蛋白Marker
有报道称一种自预染荧光蛋白Marker，能够实现蛋白Marker即是预染蛋白又是曝光蛋白。具体原理：将天然提取的荧光蛋白（包括藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等，其分子量为 20-300kDa），与能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG和能被二抗结合的抗体Fc区蛋白或肽共价偶联，由于荧光蛋白自带颜色，从而实现蛋白即是预染蛋白，又是荧光蛋白的目的，无需转膜染色或X光片成像，此外，荧光蛋白Marker条带可特异性结合一抗或者二抗，使蛋白样品和蛋白marker 经化学发光检测后，能够同时在X光片上显示出来。
此方法的优点克服了预染蛋白Marker的化学修饰（染料属于有机化合物），只是将不同功能的蛋白或多肽偶联在一起（类似于融合蛋白），不会出现电泳迁移变化，蛋白分子量不准确的现象；也不会影响和膜的结合能力，能够很好的提示转膜情况；还能实现蛋白Marker与目标蛋白显示在同一张照片上。缺点是需要将天然提取的荧光蛋白经过复杂的化学反应偶联上识别抗体的蛋白或多肽才能实现共同曝光在一张照片上，此过程操作复杂繁琐，还会造成批间差异。
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改进方向
第一种方案：利用色素蛋白Marker代替预染Marker，此类蛋白包括含铁卟啉的色素蛋白质、含黄素的色素蛋白质和含胡萝卜素的色素蛋白质等。由于蛋白没有进行化学修饰，不会出现预染蛋白Marker因为经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确的现象，也不会影响和膜的结合能力，肉眼就可以观察转膜效率。
曝光的时候，需要集普通扫描仪（类似照相机）和ECL扫描仪或者荧光扫描仪为一体的设备，先通过普通扫描仪将色素蛋白Marker成像，然后利用ECL扫描仪或者荧光扫描仪将目标蛋白成像，再利用软件将这两种照片整合在一起，由于是同一张膜，拍照未挪动位置，只是进行二次不同捕光原理成像，就不存在拼接导致位置错误，并且照片是由专业软件整合，不会出现修改和拼接痕迹。缺点是需要集普通扫描仪（类似照相机）和ECL扫描仪或者荧光扫描仪为一体的设备。
第二种方案：利用荧光蛋白的颜色（带颜色的荧光蛋白，例如藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等，代替预染），肉眼就可以判断转膜效率。同色素蛋白一样，由于蛋白没有进行化学修饰，不会出现电泳迁移变化，蛋白分子量不准确的现象；也不会影响和膜的结合能力，能够很好的提示转膜情况。
优点得到的荧光蛋白不需要进行预染处理就可以肉眼识别，也不需要进行改造去识别二抗，就可以荧光扫描。如果标记信号是荧光，仅仅使用荧光扫描仪就可以将Marker和目标蛋白显示在同一张张片上；如果使用ECL发光液，按道理也能用荧光扫描仪就可以将Marker和目标蛋白显示在同一张照片上，只是荧光蛋白需要激发后才可以产生荧光，而ECL发光属于化学发光，是通过化学反应产生荧光。
第三种方案：将荧光蛋白（带颜色的荧光蛋白，例如藻红蛋白、藻蓝蛋白、别 藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白等，代替预染）与识别抗体IgG的proteinA、proteinG或 ProteinL，以及能被二抗结合的兔源或鼠源抗体Fc区基因融合表达，由于荧光蛋白自带颜色，肉眼就可以判断转膜效率；
同时，荧光蛋白 marker中的蛋白可以识别不同来源的一抗或二抗，能和目标蛋白一起曝光显示在一张照片上，实现了荧光蛋白Marker既是自预染蛋白（自带颜色）又是曝光蛋白。由于荧光蛋白Marker没有进行化学修饰，确保了蛋白分子量准确，也不会影响电泳迁移变化和与膜的吸附能力。此外，在进行Western检测时，不需要加入额外抗体试剂，也不需要使用集成多种检测器的特殊设备，实验室常规WB检测设备就可以胜任。
转自：“Super Lab”微信公众号
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