RNA质量好不好决定下一步实验成败

导读

合格的RNA样本是进行很多实验的前提，RNA质检有很多种方法，相对来说，琼脂糖凝胶电泳是一种非常好的RNA质检方法，既能检测RNA的完整性和浓度，还能判断RNA样本中是否有蛋白和gDNA的污染情况，而且不需要依赖特殊昂贵的仪器设备。但是RNA电泳虽然简单，也有很多注意事项，如果稍有不慎，电泳过程中RNA样本发生降解，即使合格的样本也会显示出不好的质检结果。

RNA电泳 VS 其它检测方法

常用的RNA质检方法有紫外分光光度计法（Nanodrop）、Qubit法以及琼脂糖凝胶电泳等方法。其中：紫外分光光度计法（Nanodrop）是根据样本的A260和A280吸光度来判断RNA的浓度和纯度，但Nanodrop无法判断RNA的完整性，且Nanodrop无法区分DNA以及降解的RNA，因此Nanodrop检测结果可能并不准，经常发生虚高。Qubit是利用RNA结合的荧光染料来检测RNA的浓度，Qubit试剂能够区分RNA和DNA，准确性和特异性要好于Nanodrop，但是仍然存在着无法检测RNA完整性的问题。而RNA电泳则通过分析三条rRNA的条带，判断RNA的降解程度、浓度以及DNA和蛋白的污染情况。琼脂糖凝胶电泳不需要使用特殊的仪器，实验门槛更低，结果也更加多维可靠。

变性胶 VS 非变性胶

RNA电泳有变性胶电泳和非变性胶电泳两种方式。其中变性胶电泳是指在配制凝胶时加入甲醛等变性剂，能够打开RNA的二级结构，减少RNA二聚体的含量，能够精准的检测RNA的分子量。但是变性胶操作复杂，需要使用到甲醛等有害物质，因此，只有在Northern等实验中才会用到变性胶电泳。常规的RNA质检，用非变性胶电泳即可，非变性胶电泳和普通的琼脂糖凝胶电泳一样，用TAE或者TBE配制的凝胶，能够满足RNA基本的质检分析。

RNA电泳的注意事项及材料准备

RNA的电泳的步骤和所需材料，和普通DNA电泳所需的是一致的，只不过为了保证RNA在电泳过程中不被降解，所用到的器具和试剂需要用RNase-free 的。如实验要用到的电泳缓冲液（TAE或者TBE）、核酸染料、琼脂糖凝胶等试剂，一定要现配现用，且都需要用RNase free的H2O来配制（如DEPC处理过的ddH2O）。另外，电泳所需要用到的电泳槽、制胶槽、梳子也需要确保没有RNase污染，可以先用自来水冲洗干净，再用RNase free H20冲洗一次，然后用100%乙醇擦拭一次晾干备用。

RNA电泳结果判读

核糖体RNA（rRNA）是细胞中丰度最高的RNA类型，也是RNA电泳主要检测的对象。rRNA有三种类型，以真核生物为例，分别28S，18S和5S，这三种类型的rRNA分别对应了电泳结果中的三条条带。完整的RNA样本中的这三条带应该是明亮的、清晰的、无拖尾的，并且28s RNA的条带一般会比18s RNA亮（个别物种可能有例外），否则说明RNA样本已经发生了降解。另外，除了看三条rRNA条带之外，还需要看有没有gDNA（一般在28S rRNA上方）和蛋白（一般在胶孔处）的条带，如果RNA样本中有蛋白和gDNA的污染，有可能也会影响到下游的实验结果。以下是一些典型的电泳结果。

图A：提取的RNA完整性较好

图B：可以明显看到28s的条带明显弱于18s条带，RNA已经发生大量降解

图C：28s RNA条带上方和电泳孔处有条带，说明有蛋白和gDNA污染

转自：“Super Lab”微信公众号

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