PCR
PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。
其扩增过程包括三个连续步骤：
（1） 变性，对双链DNA模板进行加热，使其解离；
（2） 退火，被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；
（3） 延伸，DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。
将这些步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝（图1）。
多年以来，PCR的基本原理一直未变，但随着 DNA聚合酶 和试剂性能的大幅提升，以及 仪器 和 塑料 反应管 的不断创新，PCR实验方法也在不断改进。
图 1.PCR的三个步骤——变性、退火和延伸——目标DNA随重复循环而发生指数扩增。
DNA聚合酶
DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸（图 2）。
早期的PCR，通常使用来源于 大肠杆菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链。但是，这种 大肠杆菌酶对热敏感，易受到变性阶段高温度的破坏，从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此，需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。
热稳定DNA聚合酶的发现是一项重大进步。它实现了长时间的反应稳定性，为PCR方法的改进提供了无限可能。1976年，从耐热菌 Thermus aquaticus 中分离出来的Taq DNA 聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一 。1988年研究人员首次报道，证明 Taq DNA 聚合酶能够在 75°C以上保持活性，从而无需手动加入新鲜的酶即可持续循环扩增，实现了工作流程自动化。此外，与大肠杆菌 DNA聚合酶相比， Taq DNA 聚合酶能够获得更长的PCR扩增子，并且具有更高的灵敏度、特异性和得率。也因此，Taq DNA 聚合酶被 《科学》 杂志评为1989年的“年度分子”
尽管 Taq DNA 聚合酶大大改善了PCR实验方法，但也表现出一些缺点。例如，TaqDNA 聚合酶在90°C以上的DNA链变性温度中相对不稳定。对于需要更高解离温度的富含GC和/或具有强二级结构的DNA模板而言，这一问题尤为明显。同时，Taq DNA 酶还缺乏校正活性，会在扩增期间引入错误核苷酸。对于克隆和测序而言，序列的准确性至关重要，所以不能存在含有错配的PCR扩增子。此外，Taq DNA 聚合酶的易错配特性使其通常无法稳定扩增长度大于5 kb的片段。为克服这些缺点，性能更好的DNA聚合酶不断被开发出来，使PCR在广泛的生物学应用中发挥其强大的功能。
图 2：DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。
热循环仪
热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前，PCR反应是一个费时费力的过程，需在不同温度的水浴之间转移样品，并为每个步骤需要精确定时。热循环仪和 Taq DNA 聚合酶的发现，让PCR的自动化成为现实。第一款自动化PCR热循环仪是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合资方式引入市场的。
模板DNA
用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量为50 µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率（图 3）。
图 3.质粒和人类gDNA模板的PCR结果对比。在建议条件下，使用相同的DNA聚合酶从不同起始量的DNA模板中扩增2 kb目标序列。
有时候，PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量，特别是gDNA。拷贝数的计算取决于分子的数量，即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数（L）和摩尔质量计算拷贝数，公式如下：
拷贝数=L x 摩尔数 = L x （总质量/摩尔质量）
特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数（即其长度和单链或双链特性的组合）。
理论上，单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中，特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数，以及DNA聚合酶的灵敏度。
除了gDNA、cDNA和质粒DNA，可通过再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。尽管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用，通常建议在下一轮PCR前用水稀释反应。如需获取最佳结果，应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。
引物
PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。
除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，，以确保PCR扩增的特异性。首先，引物序列的熔解温度（Tm）必须在 55–70°C之间，两种引物的 Tm相差不超过 5°C。同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3’末端），若两个引物互补会促进退火（即，引物二聚体），自我互补会导致自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导致与模板目标区域产生不完全配对。引物的GC含量最好在40-60%之间，均匀的C和G分布能够避免错误发生。同样，为了尽量减少非特异性，引物3′端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面，引物3′端含有1个C或G核苷酸有利于引物的锚定和延伸（表 1）。
表 1.PCR引物设计的一般建议。
可以 不可以
长度为15–30 nt
Tm 55–70°C (两个引物相差不超过5°C)
40–60% GC (均匀分布)
3′末端含有1个C或G
二级结构（互补性）
直接重复序列
3′末端含有3个以上G或C
长序列引物（如， >50 nt）或碱基经修饰的引物通常需要进行 纯化 ，以去除非全长产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用，建议将引物进行纯化，序列和长度的完整性对于实验的成功至关重要。
为PCR克隆设计引物时，可在5'末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计，以尽量减小对PCR扩增和下游实验应用的影响。
在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1–1 μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3–1 μM 。通常，建议先使用标准浓度，然后根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增（图 4）。
图 4.使用不同浓度的引物对人类gDNA进行PCR扩增。 在该实验中，对富含GC的0.7 kb片段进行扩增。可以观察到，在高引物浓度下，会产生非特异性产物和引物二聚体。
脱氧核苷三磷酸（dNTP）
dNTP由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中，以实现最佳的碱基引入。但是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。
在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通常为0.2 mM。有时，使用高浓度dNTP也可能也是有益的，特别是在存在高浓度 Mg2+的情况下，因为Mg2+ 可与dNTP结合，减少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015 mM（其估计 Km值）（图 5）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（ 0.01–0.05 mM）和成比例减少 Mg2+来提高保真度。
图 5.使用不同浓度的dNTP对1 kb lambda DNA进行PCR扩增。每个反应中的MgCl2 终浓度为4 mM。
在一些应用中，dNTPs可能包含特殊核苷酸。例如，使用脱氧尿苷三磷酸（dUTP）替代dTTP，结合使用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）预处理，以防止残余PCR产物污染[2]。UDG是一种DNA修复酶，能够剪切含有尿嘧啶的DNA链。使用dUTP替代dTTP，会生成含有尿嘧啶的PCR产物。在开始PCR前，使用UDG孵育反应样品，能够去除含有尿嘧啶的污染性残余PCR产物，从而防止残余PCR产物引起假阳性结果（图 6）。
图 6.通过UDG处理，防止残余PCR扩增子污染。UDG切割DNA片段中的尿嘧啶碱基（红色线条）。经切割的DNA链在PCR条件下易于降解，因此不会在后续PCR中扩增。
在PCR中使用dUTP时，应注意如下事项。第一，dUTP取代可能会降低PCR效率和灵敏度。为克服这一问题，可采用最佳的dTTP和dUTP比例，使每个PCR产物分子携带足量的尿嘧啶碱基以有效完成UDG处理，而且不会明显影响PCR效率。第二，尽管Taq DNA 聚合酶能够在DNA合成期间掺入dUTP，但 Pfu 等校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，除非经过特殊改造而可耐受尿嘧啶。这种特性主要是因为基于 Archaea的DNA聚合酶具有尿嘧啶结合口袋作为DNA修复机制。
同样，氨基化dUTP、荧光素-12-dUTP、5-溴-dUTP和生物素-11-dUTP等改良型dNTP常被用于为后续实验加入标记物。与dUTP相似，DNA聚合酶必须能够引入经修饰的dNTP，以获得成功的PCR。
镁离子（Mg2+ ）
镁离子（Mg2+ ）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物
图 7.DNA聚合酶活性位点处镁离子的作用。在DNA聚合期间，Mg2+ 可帮助协调引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间发生相互作用。
通常情况下，Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能，诸如 Pfu DNA 聚合酶等一些聚合酶首选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要对镁离子浓度进行优化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。
在PCR中，标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误（图 8）。
图 8.使用不同浓度的MgCl2进行PCR扩增。最上方条带代表从人类gDNA扩增得到的2.8 kb目标片段。
缓冲液
PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。
对于 Taq DNA 聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K+)，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性（图9）。
图 9.缓冲液离子对DNA双链形成的影响。钾离子和镁离子 (K+和 Mg2+) 能够与DNA骨架上的磷酸基团 (P–) 结合并稳定双链形成，而铵离子 (NH4+) 能够与碱基（N）之间的氢键相互作用并破坏双链形成。
由于 Mg2+ 与K+具有相似的稳定效应，因此，当使用KCl缓冲液时， MgCl2 的建议浓度通常较低(1.5 ± 0.25 mM) ，当使用(NH4)2SO4 缓冲液时，MgCl2的建议浓度通常较高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于NH4+ 与Mg2+具有拮抗效应，因此，在各种 Mg2+ 浓度下，含有(NH4)2SO4 的缓冲液都表现出更高的引物特异性（图10）。由于最佳的PCR缓冲液取决于所使用的DNA聚合酶类型 ，所以有必要遵循酶供应商的提供的缓冲液建议。
图10.使用含不同 MgCl2 浓度的两种不同缓冲液获得的PCR结果，表明选择合适缓冲液对于PCR扩增特异性的重要性。在该反应中，使用 Taq DNA 聚合酶从人类gDNA扩增0.95 kb的片段。
在某些情况下，可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特异性，并通过去除二级结构来提高扩增效率（表 2）。此外，一些DNA聚合酶 还随附提供 了专为DNA聚合酶和PCR缓冲液优化的特殊增强剂 。这些试剂常用于困难样品，如富含GC的模板。应注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、 Mg2+ 结合以及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用——例如，基因芯片实验中的非离子去污剂。因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分。
表 2.用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂，以及其建议终浓度[6]。
试剂 标准终浓度
二甲基亚砜（DMSO) 1–10%
甘油 5-20%
甲酰胺 1.25–10%
牛血清白蛋白（BSA） 10–100 µg/mL
硫酸铵(NH4)2SO4) 15–30 mM
聚乙二醇（PEG） 5-15%
明胶 0.01%
非离子去污剂（如，Tween 20, Triton X-100） 0.05-01%
N,N,N-三甲基甘氨酸（甜菜碱） 1–3 M
转自：“Super Lab”微信公众号
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