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关于细胞标记和荧光素酶的特性
1. 荧光素酶的发光是否需要激发光？
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素(Luciferin)。
2. 荧光素酶的发光特性如何？
荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点持续约20-30 分钟后开始衰减，约三小时后荧光素排除，发光全部消失。最好的检测时间是在注射后15到35分钟之间
3. 底物荧光素(Luciferin)是如何进入小鼠体内的？需要多少？
荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg 。20克的小鼠需要3毫克的荧光素，价钱约两到三美元。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。
4. 荧光素的体内代谢过程
不同品牌的荧光素底物的代谢过程不太一样， 使用前最好做一些体外试验，做一个标准曲线。下面是我们试验的一些例子：
5. 两次观察间隔时间最短为多长时间？
观察时间的间隔没有最短限制， 只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。
6. 荧光素酶基因，荧光素酶，荧光素底物有多大？可以透过血脑屏障吗？
荧光素酶有554个氨基酸，约50KD。荧光素酶的底物荧光素，约280道尔顿。荧光素的水溶性和脂溶性都非常好, 很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
7. 做体内实验的luciferin 与体外实验的是不是一样，如何购买？最小包装多大？
体内生物发光是用的是D-Luciferin，我们提供1g或小到100mg 的包装。
8. 如何保证荧光素酶(Luciferase)的稳定性？
荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时, 所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。
9. 标记的肿瘤接种以后，会发生luciferase的丢失吗？
没有正式的报道丢失Luciferase的情况。丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase基因的标记非常稳定。
10. 在in vitro 的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？
荧光素酶基因标记的细胞株是经过单克隆筛选培养过的稳定的细胞株。体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长， 接种代数不要很多。到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度。
11. 可以用肿瘤块而不是细胞接种吗？
可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。
12. 荧光素酶基因在标记的细胞中有多少个COPY，在什么位点？
细胞中的copy数目，和标记的位点对于实验没有任何影响，后来的实验中基本不进行那样的研究。
13. 标记细胞与标记基因所用的启动子有何不同？
标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子, 显示细胞的数目。标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达, 显示此基因的表达数目。
14. 荧光素酶的表达高低与所用启动子的活性有关吗？
有关，启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。还可以根据此原理，用特定的启动子驱动荧光素酶，来观察该启动子在活体动物体内的特定条件下的表达情况，并检测影响该启动子表达的因素。这正体现了应用活体成像技术研究的优势。
15. 有几种常用的荧光素酶？特性如何？
常用的有两种荧光素酶，Luciferase 和 Renilla荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine 。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在540-600nm，后者所发的光波长在460-540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。大部分的发表文章通常使用前者用作报告基因， 也有一些文章使用两者进行双标记。
16. 组织切片可以观察到生物发光吗？
可以，但荧光酶的体外活性保持时间比较短， 约几十分钟。有相关的文献。
17. 标记好的细胞的荧光素酶是随机还是插入固定的位点？
插入的位点是随机的，但每一个构建好的细胞株我们都做过详细的分析，与其母细胞株进行详细的比较，证明荧光素酶的插入对细胞的各种特性(包括生长周期, 成瘤性等)没有造成影响。
18. 能标记病毒吗？能标记病毒的某一个基因吗？
可以标记病毒，由于病毒在核酸结构上的特性，每个病毒标记的方法不一样，具体的可以参见有关文献。还没有看到标记病毒某一个基因的报道， 但理论上讲，将荧光素酶基因与想标记的基因平行表达，可以标记任何基因。
19. 细菌标记问题
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
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关于仪器的特性等问题
20. 为何生物发光成像技术能看到体内发出的可见光？
两个主要原因使可见光成像技术能够看到体内发出的微弱的可见光。一是高灵敏度的制冷CCD镜头，可达到零下-105°C，使体内发出的非常少的光子也能够检测到。二是绝对密封的暗箱装置，可以屏蔽包括宇宙射线在内的所有光线。
21. 正常成体小鼠可以看到体内发光吗？是否不需要裸鼠？
可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同，我们的技术可以看到成体正常老鼠的体内发光。这正是这项技术的价值所在。可见光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作为活体成像的动物， 并有很多关于大鼠的文章。
22. 能检测在组织内部的发光吗？光能透过肌肤多深？
可以。若有发光足够强的标记细胞，在老鼠体内任何一个地方都能看到约一立方毫米的细胞瘤(约106细胞)。穿透性可达到3-4CM (小鼠身体厚度约7-8 CM)。
23. 仪器灵敏度如何？
仪器对发光细胞检测的灵敏度与细胞发光的强度有关。在标记细胞活跃发光的情况下， 仪器可以检测到最少100个皮下接种的发光细胞。若细胞在体内位置深(如原位种植)，比如内脏，最少能检测到的细胞数目需要多一些。一般每增加0.5cm可检测到的最少细胞数增加一个数量级。具体评论见BLOOD 2003 年的一篇文章：
“the sensitivity of cell detection in vivo is surprisingly high and exceeds even the sensitivity of detection by flow cytometry ex vivo. As few as 7x103 cells are detectable in the lungs early after injection, 2-2.5x104 cells within liver or spleen, and as few as 1x104 tumor cells within the BM of a femur give rise to a sufficient signal to be detected externally. In other experiments using cells with even higher luciferase expression, as few as 100 cells can be reliably detected in the peritoneal cavity of living animals. BLOOD, 2003, V.101, pp640-8
24. 能检测分散在各处的单个细胞吗?
可以检测到流体的细胞，只要细胞总数达到100以上。许多文章，其中用荧光素酶标记了T细胞, NK细胞, 造血干细胞和其他淋巴细胞。在这些标记的细胞总数达到一百以上时，我们的仪器可以观察到信号（见上篇关于T细胞的索引）。
25. 活体成像技术如何定量分析？
活体可见光成像技术采取绝对光子数的计算方法，记录单位时间内、单位面积、单位角度接受到的光子数。这样，不同时间、不同仪器的测量结果可以进行比较，具有绝对的定量意义。每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验，其中包括在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线。
26. 不同的组织对光的吸收程度不一样，不同的组织之间能进行定量研究吗？
不能。目前的文献都是同样的组织比较，进行同样组织的前后不同时间的定量分析。
27. 荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比？
是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点, 包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。密西根大学Brian Ross发表的一篇文章专门研究了这个问题。确定荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9 以上。
28. 仪器的解析度如何？分辨率如何？
仪器的最高解析度在0.1毫米左右。由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光
不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。小动物CT和MRI，在这方面具有优势，因为放射线走的路线很直。
29. 能定位在哪个脏器吗？凭什么？当进行肿瘤转移研究的实验时，在观察期间，不杀死动物，如何判断某一部位发光是由于皮肤、皮下组织，肌肉，脏器还是骨骼的肿瘤转移造成的发光？特别是对于一些较小的脏器，如淋巴结转移。
此技术无法直接定位标记细胞和基因所在的组织和器官。但是实验人员凭经验，可以靠发光细胞在老鼠的身体位置推断标记细胞或基因所在的脏器。若需要证实, 还需要将老鼠解剖，进行体外检测。
30. 拍摄普通照片的和生物发光照片的是一个CCD镜头吗?
是, 只不过爆光时间和快门不一样。
31. 镜头那么低温度，动物不会冻死吗？
低温只是在CCD镜头的小环境内。其它范围内都是室温。
32. 使用麻醉机相对于腹腔注射麻醉有什么优点？
麻醉系统可以对小鼠的麻醉情况包括时间，程度等有更精确的控制。使用起来也会更加方便。
33. 荧光配件相对于其他公司的荧光的优势在哪里？
相对宽的应用范围，可以观察波长在400-900nm的荧光，因此适用于GFP及各种荧光染料的标记。还有一套12张专门的滤光片用来消除非特异性的背景光。并且其成像速度快，适合大批量的实验。
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关于生物发光与荧光及其它技术的比较
34. 荧光检测与生物发光检测的优势与劣势比较如何？
荧光发光需要激发光，但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发, 它是以酶和底物的特异作用而发光, 且动物体自身不会发光，这样生物发光就具有极低的背景。虽然荧光信号远远强于生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。另外，生物发光信号可以用于精确定量。因为荧光酶基因是插入细胞染色体中稳定表达的，单位细胞的发光数量很稳定。即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。而对于荧光，光在体内路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度，光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。因为这些原因，目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。但是，荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和简单的动物体内研究方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法。
35. 为什么用荧光素酶, 而不是用绿色荧光蛋白来检测体内发光?
一方面是荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。另一方面, 荧光 素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强。这样一来，得到的信噪比很高。而荧光蛋白需要激发光来产生反射光。老鼠的毛皮、肌肤以及一些食物都会产生非特异性荧光，造成很强的非特异性背景光，得到的信噪比很小。虽然荧光蛋白的发光强度很高，大量应用于体外检测；但荧光酶标记的方法更适合于体内检测。荧光酶体内检测的灵敏度要比荧光蛋白在体内的灵敏度至少高三个数量级(1000倍)。
36. 发光的波长与体内的穿透性如何关系？
荧光素酶发出的光主要是偏红光，与绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光不同。荧光素酶的偏红光比绿色荧光蛋白的绿光在体内的穿透性要强近一百倍。因为光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。
37. 相对于传统技术，生物发光成像技术的优势在哪些研究领域？
该技术是一项在某些领域有很大不可替代优势的技术，但是并不是万能的技术。与传统技术相比，肿瘤转移研究，基因治疗，流行病学的发病学研究，干细胞示踪，白血病的相关研究等是该技术非常有优势的领域。在药物开发方面，用该技术进行肿瘤的药效研究，比传统方法更灵敏，还可以通过一系列转基因疾病动物模型，来快速直观的进行相关疾病的发病机理和药物筛选研究。
38. 生物发光成像不能标记的领域？
小分子药物，多肽等。这些方法现今为止的最好的标记方法还是以放射性标记。
39. 生物发光成像和小动物CT比较有什么特点和优势？
小动物CT的基本原理是利用X射线成像，通过对所观察对象的密度变化，进行动物内部结构方面的研究。他的优点是分辨率高，不需标记。缺点是特异性差， 在肿瘤很小时无法区分肿瘤细胞和正常细胞，并且对于肿瘤细胞的活跃程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇关于乳腺癌骨转移的文章里，详细比较了小动物CT与生物发光成像在肿瘤转移方面的灵敏度。小动物CT要在接种16天以后，成瘤很明显后才能够观察到骨转移的存在。而生物发光成像在接种后当天就可以实时观察到癌细胞的转移和走向。并且，小动物CT需要对动物有较强的X-射线照射， 容易引起突变，对动物的生理有一定影响。
40. 小分子药物的标记用荧光与PET，哪一个更好？
如果用荧光蛋白，可以标记细胞或病毒。如果使用合适的荧光小分子， 如Cyt5.5等，可以标记蛋白例如抗体等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子药物等，只能用放射性同位素标记， 用PET或SPECT的方法进行研究。因为即使荧光基团如Cyt5.5也会影响小分子药物的药理药效和代谢活动。
41. 体内可见光技术和其它体内成像技术(PET, CT, 及MRI)的比较
简单优点：适用于小动物的研究，灵敏度高，特异性好，操作简单，无放射性，价钱便宜。缺点：无法标记小分子药物，暂不适用于人类和临床(正在研究中)，分辨率低，体内精确定位有限。
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关于技术应用
42. 可以用荧光素酶基因标记干细胞吗？如何标记？
可以，标记干细胞有几种方法。一种是标记组成性表达的基因，做成转基因小鼠，干细胞就被标记了，从此小鼠的骨髓取出造血干细胞，移植到另外一只小鼠的骨髓内，可以用该技术示踪造血干细胞在体内的增殖和分化及迁徙到全身的过程。另外一种方法是用慢病毒标记神经干细胞。以上内容都有相关的文献报道。
43. 该技术在抗肿瘤新药研究方面的应用如何？
在用该技术进行抗肿瘤新药的研究方面，主要是药效学评价。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法，还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。还有由于该技术只是检测活跃的细胞，那些已经凋亡的癌细胞是检测不到的，而用传统的方法，不能区别正常的癌细胞与凋亡的癌细胞，所以该技术可以比传统技术更早的发现药物的疗效，比传统方法更灵敏。目前已经应用该技术进行的抗肿瘤药效研究的有SU11248（乳腺癌新药），Topotecan（已经上市的抗肿瘤） 等。
44. 蛋白质与蛋白质的关系，如何研究？
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用体内可见光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。具体方法是：将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用,，荧光酶的C端和N端就会被带到一起, 产生发光现象.。详细内容见文章。
45. 可以研究药物对蛋白质相互作用吗？
可以。在活体条件下应用该技术研究药物对蛋白质相互作用的影响。可以把在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响也计算在内（PNAS04）。
46. 可以研究蛋白质核运输吗？
可以。研究方法类似于研究蛋白质相互作用的方法。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N断、C端靠近，恢复发光。
47. 可以用该技术研究基因表达吗？
可以，研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk细胞分裂周期的表达Nature Medicine 2004）, 兴趣基因启动子控制的荧光素酶（Catenin在肿瘤转移的信号传导机制Nature 2005）, iRNA方式（HCV-luc的iRNA抑制表达Nature 2002）, 和转基因动物（NFkB在Hypoxia的表达JCI 2004）等方法。若有兴趣，可以与我们索取相关文章。
48. 细胞凋亡的研究
PNAS(美国科学院院报)上发表的一篇文章介绍，可利用体内可见光成像技术直接观察活体动物体内的细胞凋亡(附上细胞凋亡的文章)。具体方法是：用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上CASPASE(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达CASPASE，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光酶开始发光。详细内容见文章。
49. 该技术只是能示踪细胞的走向，而不能进行相关的机理研究？
不对。该技术最初的应用是在观察肿瘤细胞、病原微生物或干细胞的走向，分布等，但是目前随着该技术的普及，其应用已经扩展到很多方面，原来只能在分子水平上研究的内容，现在也可以在整体动物水平上进行更接近活体环境状态的研究，如蛋白质相互作用，细胞凋亡，基因表达等等。基本上把分子生物学在体外的一些研究方法在体内进行实现。由于体内与体外的各种微环境上的差异，造成体外实验结果对活体生物机理研究的局限性，相信在整体水平的研究，必将有广阔的发展空间。
50. 在药物临床前研究中的应用如何？
利用活体成像技术高灵敏度，观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同的剂量，并不同的给药时间、不同的给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量并给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。我们搜集了许多药物研究方面的相关文献，请同我们联系， 希望与您共享。
51. 相对于传统技术，在肿瘤学研究中的优势在哪里？
有更高的灵敏度，可以定量研究，可以方便的观察肿瘤转移与复发的情况，可以避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异，可以节省动物的成本。并且应为这项技术的超灵敏性，微小的肿瘤转移兆（少到100多个细胞）就可以检测到。比用传统方法可以检测到的灵敏度大大提高。也可应用转基因技术制作自发肿瘤模型从事相关的研究。
52. 如何利用该技术研究药物代谢？
标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。并且，小分子及多肽药物也可以利用荧光素（如Cyt 5.5等）标记， 观察它们在动物体内的走向，变化及代谢等。
53. 如何进行相关疾病机理的研究？
可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下，该基因表达的变化，来推测该疾病的发病机理，药物对该疾病治疗的效果等。我们已经标记好了几十种转基因动物提供给研究人员，也提供相关方面的服务。
54. 在中医学方面的应用前景如何？
由于该技术在整体动物水平上观察生物学变化，与中医的整体观念有些相似。目前，有很多中药在治疗疾病上有很好的疗效，但是由于其复杂的组分，复杂的作用机理，很难用目前的分子水平的研究解释清楚。如果从宏观的水平，根据所研究内容的不同，应用该技术的一些疾病模型，从基因表达等方面观察某些中药的治疗效果，将是一个不错的方向。台湾的中医学界在这个方面有很深的研究。
55. 在免疫学领域应用如何？
观察流体细胞在体内的动向和变化使这个技术的一大优势。可以标记免疫细胞，如T 细胞，NK细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀死。也可以标记干细胞及异体细胞，观察干细胞烟花和器官移植的研究。也有一些关于免疫因子的研究报道等。
56. 在RNA阻断方面的应用如何？可以标记siRNA吗？
可以用荧光素酶基因标记兴趣基因，利用荧光素酶的iRNA观察其对兴趣基因的表达抑制（Nature 2002）. 也可以标记肿瘤细胞，间接观察阻断RNA对肿瘤细胞的识别和杀伤。
57. 相对传统技术，在抗生素药物筛选方面的优势如何？
同一批老鼠持续观察，避免个体间差异；有更高的灵敏度，可以在感染早期就进行活体观察。可以有结构信息，在活体动物整体上观察感染途径。定量，可以比较各个器官的感染程度，更直观。
转自：“Super Lab”微信公众号
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