导读
急性肺损伤（ALI）以快速、严重的呼吸窘迫和长期低氧血症为特征。一种被称为扶正解毒方（FZJDF）的中药在临床和实验研究中都被证明具有抗炎作用，然而，具体的基本过程尚不清楚。本研究从肠肺轴的角度探讨FZJDF对ALI的保护作用机制，分析了FZJDF对脂多糖（LPS）诱导的ALI小鼠模型的影响，并测定了肺损伤评分、血清白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，以证实其抗炎作用；此外，分别使用宏基因组测序和高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱进行肠道微生物群分析以及血清和粪便样本代谢组学。FZJDF显著诱导LPS诱导的ALI引起的组织病理学变化，并下调血清IL-1β和TNF-α的浓度。此外，FZJDF对肠道微生物群紊乱有影响，线性判别效应大小分析确定信号转导、细胞运动和氨基酸代谢是FZJDF的潜在作用机制。我们对LPS和FZJDF组中的几种代谢产物通过非靶向代谢组学分析进行了区分。微生物群的相对丰度和代谢产物之间存在相关性。综合网络分析揭示了肺损伤、肠道微生物和代谢产物之间的联系。在LPS诱导的ALI中，肺和结肠组织中甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的表达失调，FZJDF逆转了这些趋势。本研究揭示了FZJDF通过调节肠道-微生物-肺轴的氨基酸代谢，对LPS诱导的小鼠ALI具有显著的保护作用，并为疾病的多系统联系提供了全面和深入的认识。
论文ID
原名：Fuzhengjiedu formula exerts protective effect against LPS-induced acute lung injury via gut-lung axis
译名：扶正解毒方经肠-肺轴对LPS诱导的急性肺损伤有保护作用
期刊：Phytomedicine
IF：7.9
发表时间：2023.11
通讯作者：蔡书宾&刘云涛&杨荣源&李际强
通讯作者单位：广州中医药大学第二附属医院(广东省中医院)
实验设计
实验结果
1. FZJDF对LPS致肺损伤的影响
与对照组相比，LPS组的肺组织表现出严重的病理变化（即渗出、出血、肺泡塌陷和炎症细胞浸润）（图2A）。低剂量（FZJDF_L）、中剂量（FZJDF_M）和高剂量（FZJDF_H）组的肺损伤评分显著低于LPS组（图2B）。此外，与对照组相比，LPS导致血清中IL-1β和TNF-α水平显著升高（图2C，D）。不同剂量的FZJDF显著下调了IL-1β和TNF-α水平。与肺组织一致，与对照组相比，LPS诱导的小鼠结肠也表现出显著的炎症细胞浸润，FZJDF改善了结肠的组织病理学变化（图2E）。
已证实诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和TNF-α是M1巨噬细胞的生物标志物。为了确定FZJDF是否对ALI小鼠巨噬细胞极化具有调节作用，我们使用RT-qPCR来测定肺组织中iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平。如图2F-H所示，与对照组相比，LPS组肺组织中iNOS、IL-1β和TNF-α的mRNA表达显著增加，这意味着LPS刺激了ALI过程中M1巨噬细胞极化的激活。FZJDF和地塞米松（DXM，阳性药）处理可显著降低IL-1β和TNF-α的表达，而只有高剂量的FZJDF（FZJDF_H）可显著降低上调的iNOS水平。为了研究FZJDF对代谢产物和肠道微生物群的调节作用，我们将不同剂量的FZJDF合并为一组，以进一步分析潜在的作用机制。
图1 FZJDF研究策略的工作流程ALI的治疗。FZJDF，扶正解毒方；ALI，急性肺损伤。
图2 FZJDF对LPS给药后肺损伤的影响。（A）肺的HE染色（×200和×400，比例尺=50μm，对照组、LPS组和DXM组的动物，n=5；FZJDF_L、FZJDF_M和FZJDF_H组的动物，n=4）。（B）各组肺的组织学损伤评分。（C）各组的血清IL-1β表达（每组动物，n=5）。（D）各组血清TNF-α的表达。（E）结肠HE染色（×200和×400，比例尺=50μm，对照组、LPS组和DXM组动物，n=5；FZJDF_L、FZJDF_M和FZJDF_H组的动物，n=4）。（F）各组肺组织中iNOS mRNA的表达（每组动物，n=5）。（G）各组（每组动物，n=5）肺组织中IL-1β mRNA的表达。（H）各组（每组动物，n=5）肺组织中TNF-α mRNA的表达。数据显示为平均值±标准偏差。LPS，脂多糖；DXM，地塞米松（1.5 mg/kg）；FZJDF，扶正解毒方；FZJDF_L，FZJDF低剂量组（3.3g/kg）；FZJDF_M，FZJDF中剂量组（6.6g/kg）；FZJDF_H，FZJDF高剂量组（13.2g/kg）。ANOVA，方差分析；iNOS，诱导型一氧化氮合酶；IL-1β，白细胞介素-1β；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；与LPS组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，不显著。
2. 血清样本代谢组学分析
为了弄清楚LPS诱导的小鼠模型和FZJDF处理小鼠中所有代谢物的差异，我们对血清样品进行了非靶向代谢组学研究。3D-PCA评分图显示，四组小鼠的代谢谱分布在不同的区域（图3A，B）。
图3 在负离子模式（A）和正离子模式（B）下，从对照、LPS、DXM、FZJDF组的小鼠和质量控制样品中收集的PCA评分图。（C）负离子模式和（D）正离子模式下的PLS-DA得分图。（E）负离子模式下的OPLS-DA得分图，以及通过置换检验对相应的OPLS-DA模型的统计验证；（F）正离子模式下的OPLS-DA得分图以及通过置换检验对相应的OPLS-DA模型进行统计验证，R2是解释的方差，Q2是模型的预测能力。LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方；QC，质量控制。
PLS-DA和OPLS-DA模型用于确认所有组之间的分离（图3C–F）。置换检验用于验证OPLS-DA模型的适用性，其中R2和Q2用于说明拟合和预测的能力。蓝色回归线的交点，Q2位于左纵坐标上的零以下，表明模型没有过度拟合。
我们共鉴定出208个分子类别，其中氨基酸、肽、类似物、胆汁酸、醇和衍生物、碳水化合物和碳水化合物偶联物、脂肪酸酯、脂肪酸和偶联物、甘油磷酸胆碱、甘油磷酸乙醇胺、甘油磷酸肌醇和磷酸鞘脂，对各组之间的差异代谢物具有最强的影响（图4A）。
我们使用OPLS-DA通过整合VIP值（VIP>1）和t检验的p值（p<0.05）来筛选与LPS诱导的ALI相关的差异代谢产物。与对照组和LPS组相比，负离子模式下77种代谢产物和正离子模式下87种代谢产物发生了变化（补充表3和4），其中三种得到了FZJDF的显著支持，包括Pc（16:1e/17hdohe）、水苏碱和dibuciaine（图4B）。
为了进一步了解FZJDF抗炎作用的机制，我们将不同的代谢产物输入MetaboAnalyst 5.0进行通路分析。最后，许多代谢途径被LPS扰乱（图4C），然而，FZJDF和DXM显著调节三种代谢途径：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢。
图4 （A）各组之间血清样本中的不同分子类别。（B）对照组和LPS组小鼠差异代谢产物表达的比较，FZJDF组对差异代谢产物的表达有显著调节作用。（C）差异血清代谢产物通路分析汇总图。每个圆圈的大小和颜色分别基于路径影响值和p值。序列号1-3指示的代谢途径如下：1，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；2，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；3，半胱氨酸和蛋氨酸代谢。LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方；ANOVA，方差分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，与LPS组相比不显著。
3. 粪便样本代谢组学分析
粪便样品的非靶向代谢组学用于证实FZJDF对肠道代谢的影响。我们共鉴定了286个类别，并观察到13个类别（包括胺、氨基酸、肽和类似物、苯甲酸及其衍生物、胆汁酸、醇和衍生物等）对各组之间不同的代谢产物具有强大的影响（图5A）。如图5B所示，FZJDF调节8种被LPS阻断的代谢产物，包括鸟嘌呤、L-苏氨酸、反式肉桂酸、2-脱氧-D-核糖、L-缬氨酸和苏氨酸。FZJDF和DXM调节富集的途径，包括苯丙氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；嘧啶代谢；赖氨酸降解；卟啉和叶绿素代谢；柠檬酸循环（三羧酸循环）；丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生（图6）。
图5 （A）各组之间粪便样本中的不同分子类别。（B）对照组和LPS组小鼠粪便样品中差异代谢产物的表达比较，FZJDF可以显著调节差异代谢产物。LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方；ANOVA，方差分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns，与LPS组相比不显著。
4. 肠道菌群的组成
在α多样性分析中，我们采用Shannon和Simpson指数来评估细菌群落的复杂性。invsimpson指数是一个具有一致均匀性和相同多样性水平的群落丰度指标。如图7A所示，Shannon、Simpson和invsimpson指数在四组之间存在显著差异。LPS增加了物种多样性，DXM处理可逆转这种情况。FZJDF显著降低了invsimpson指数，表明FZJDF可以将受干扰的多样性恢复到相同的水平，尽管它对Shannon和Simpson指数没有影响。β-多样性，旨在比较不同样本之间微生物群的多样性。PCA（PCA1=38.79%，PCA2=22.31%，图7B）、基于AltGower距离的PCoA分析（PCoA1=42.88%，PCoA2=25.13%，图7C）和基于Bray-Curtis距离的MDS分析（图7D）显示了对照组和LPS组之间的显著分离。FZJDF组的样本在对照组和LPS组之间广泛分布，表明FZJDF使ALI向正常状态小鼠的肠道微生物群靠拢。
图6 不同粪便代谢产物的通路分析汇总图。每个圆圈的大小和颜色分别基于路径影响值和p值。序列号1-8指示的代谢途径如下：1，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；2，苯丙氨酸代谢；3，丙酮酸代谢；4，糖酵解/糖异生；5，柠檬酸循环（三羧酸循环）；6，卟啉与叶绿素代谢；7，赖氨酸降解；8，嘧啶代谢；LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方。
5. 属水平上肠道微生物群的组成
图7E显示了四组在属水平上具有优势的前20个肠道菌群的相对丰度。物种组成分析表明，LPS在属水平上显著改变了ALI小鼠肠道菌群的物种组成，FZJDF重塑了ALI鼠肠道菌群组成。g_Alistipes和拟杆菌属在LPS诱导的ALI小鼠中更丰富，而乳杆菌属在对照组、DXM组和FZJDF组中更丰富。
接下来，我们研究了四组之间肠道微生物组的具体组成差异，鉴定了几种不同丰度的微生物群，包括g_Candidatus_Amulumruptor和g_Parabacteroides，o_Bacteroidales（图8A，补充图1），其区分了健康小鼠和LPS诱导的ALI小鼠的肠道微生物组，DXM和FZJDF处理显著逆转了这些趋势。
图7 对照组、LPS组、DXM组和FZJDF组的（A）α-多样性分析，（B）PCA分析，（C）AltGower距离的PCoA分析，以及（D）基于Bray–Curtis距离算法的度量多维标度分析。（E）属水平前20个微生物群的相对丰度。PCA，主成分分析；PCoA，主坐标分析；LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方。
6. 预测性功能宏基因组
我们进一步探讨了四组之间肠道微生物群功能组成的差异。在LEfSe分析中，LDA得分越高，功能途径的影响就越大。LDA评分>3意味着统计学上的显著差异。对于KEGG水平为B的途径，如图8B所示，DXM对肠道菌群的药效作用主要作用于感觉系统、细胞群落原核生物、细胞运动和膜转运途径，而FZJDF作用于信号转导、细胞活动和氨基酸代谢。对于血清代谢组学中鉴定的三种途径，g_Ligilactobacillus、乳杆菌属、g_Limosilactobacillous、g_Alistipes、梭菌属、g_Adlercreutzia、拟杆菌属、g_Odoribacter、g_Previotellag、g_Millionella、罗氏菌属、螺杆菌属、g_Oscillibacter、g_Acutalibacter和优杆菌属是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢的主要物种（图8C）。进一步的相关性分析表明，g_Lancefieldlla、g_Pseudoprevotella、f_Coriobacteriaceae、g_Chitinophaga、g_Mediterranea、g_Porphyromonas、g_Emergencia、g_Candidatus_Amulumruptor、g_Parabacteroides和o_Bacteroidales的相对丰度与上述三种氨基酸代谢途径显著相关（补充图2）。
图8 （A）对照组和LPS组在属水平上的差异微生物群的相对丰度，FZJDF可以显著调节。（B）对照组、LPS组、DXM组和FZJDF组在KEGG途径水平B的LEfSe分析。（C）KEGG通路水平C由其分类学贡献者注释。LEfSe，线性判别分析效应大小；LDA，线性判别分析；LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方；KEGG，京都基因和基因组百科全书。
7. 肺损伤、差异代谢物和肠道菌群的相关性
我们使用Spearman的相关数据构建了关联分析热图和“肺损伤代谢产物-肠道微生物群”的可视化集成网络图（图9A-B），将四个肺损伤数据集、血清和粪便样本中的十种差异代谢物以及与三种氨基酸代谢途径显著相关的十种肠道菌群整合到网络中。10种肠道菌群中有8种与肺损伤评分呈显著相关性（正相关或负相关），表明肠道菌群可能影响小鼠ALI。此外，不同的代谢产物大多与不同的肠道微生物群呈正相关或负相关。如热图和网络所示，肺损伤与不同的代谢产物和肠道微生物群密切相关，表明ALI与代谢和肠道微生物组疾病密切相关。
图9 （A）组内分析和（B）Spearman分析确定与LPS诱导的ALI相关的肺损伤、差异代谢产物和肠道微生物群的相关性网络。（A）蓝色和红色分别代表正相关性和负相关性。p值和颜色的深度表示相关性的程度。（C）肺和结肠组织中甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸表达的氨基酸试剂盒验证。LPS，脂多糖；DXM，地塞米松；FZJDF，扶正解毒方；ANOVA，方差分析；Methanone①，Methanone, [6‑hydroxy-1-[2-(4-morpholinyl)ethyl]− 1h-indol-3-yl]−1-naphthalenyl-；Heptanoic acid②，(6r)− 2-(hydroxymethyl)− 6-((3r,5r,7r,8r,9 s,10 s,12 s,13r,14 s,17r)− 3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethylhexadecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)heptanoic acid。与LPS组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns，不显著。
8. 氨基酸代谢失调的验证
根据多组学分析结果，差异代谢产物和肠道微生物组与氨基酸代谢途径的失调显著相关。其中，我们选择了甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸，并使用商业试剂盒测量了它们在肺和结肠组织中的表达。如图9C所示，甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸在肺和结肠组织中均下调，而谷氨酸和蛋氨酸上调。FZJDF显著扭转了这些趋势。这些结果表明FZJDF对LPS诱导ALI的保护作用与氨基酸代谢密切相关。
图10 LPS诱导的ALI小鼠中代谢产物失调和肠道菌群的示意图。氨基酸代谢是肠肺串扰的关键因素，FZJDF通过肠道-微生物群-肺轴调节氨基酸代谢来保护小鼠免受LPS诱导的ALI。LPS，脂多糖；FZJDF，扶正解毒方；ALI，急性肺损伤。
讨论
本研究通过对血清和粪便样本应用完整的宏基因组测序技术和代谢组学，检测了肠肺轴与抗ALI作用的关系。本研究的关键发现如下：FZJDF在小鼠模型中对LPS诱导的ALI具有显著的保护作用。其次，非靶向代谢组学分析显示，LPS和FZJDF组之间存在许多失调的化合物，差异代谢产物的通路富集，表明FZJDF显著调节氨基酸代谢途径。第三，对肠道菌群的可预测功能分析表明，FZJDF和LPS改变了一些氨基酸代谢可能发挥重要作用的KEGG途径。第四，综合网络分析显示，肺损伤与几种代谢产物和微生物群有关，表明肠道微生物群与肺功能之间可能存在相互作用。最后，甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸在肺和结肠组织中的表达失调，FZJDF逆转了这些趋势。因此，目前的数据表明，FZJDF对LPS诱导的ALI具有保护作用，并通过肠肺轴调节氨基酸代谢。
橙皮苷、甘草苷和6-姜酚是FZJDF的主要化学标志物，在ALI治疗中具有潜在作用。橙皮苷在炎症性肺部疾病中具有抗炎、抗细胞凋亡和保护作用，包括通过潜在地调节髓样分化蛋白-2对LPS诱导的ALI具有显著的保护作用，以及通过抑制TNF-α、高迁移率族蛋白1和核因子κB（NF-κB）途径发挥抗炎特性，使其成为ALI的一种潜在辅助治疗候选物。研究表明，甘草素通过抑制c-Jun N-末端激酶激活和抑制Nur77/c-Jun信号通路，有可能减轻ALI，从而为ALI和相关炎症疾病提供一种潜在治疗候选药物。此外，一项研究表明，6-姜酚增强了细胞活力，抑制了NF-κB和MAPK通路，并降低了促炎因子，包括IL-1β和TNF-α。这些发现为FZJDF在ALI治疗中的潜在作用提供了见解，并为未来研究FZJDF治疗机制提供了参考。
许多靶细胞和效应细胞被认为参与了ALI的病理生理学。肺巨噬细胞是这些细胞中的一种，被认为是重要的先天免疫细胞。它们是抵御空气中微生物和颗粒的第一道防线，据报道参与了ALI的发病机制，包括炎症反应的调节和受损肺组织的修复。在ALI期间，肺泡巨噬细胞极化为M1表型，并具有促炎作用。调节巨噬细胞极化可以改善ALI的预后。在我们的研究中，FZJDF显著降低了血清中的IL-1β和TNF-α水平，以及肺组织中iNOS、IL-1β、TNF-α mRNA的表达，表明FZJDF能够有效抑制肺泡巨噬细胞向M1表型的极化。
人们普遍认为，肠道菌群与肺部相关疾病的发展之间有着密切的联系。肠道细菌除了对胃肠道的局部免疫至关重要外，在控制系统免疫方面也发挥着重要作用。肠道菌群对于保持健康的免疫系统、防止细菌移位和改善肺部损伤至关重要，这表明肠道和肺部之间存在相互作用。在这项研究中，我们应用了小鼠ALI模型，发现肠道菌群的相对丰度发生了变化。FZJDF改善了LPS刺激引起的肠道菌群差异，并调节了肠道微生物群的丰度和多样性。此外，对不同肠道菌群的预测功能分析表明，肠道菌群失衡可能导致氨基酸代谢失调。
免疫反应由许多基本过程控制，包括代谢程序。氨基酸代谢失调与ALI有关。先前的研究表明，在LPS诱导的ALI中，减少谷氨酰胺代谢可加速急性肺损伤的恢复，甲硫氨酸限制可减少炎症、炎症细胞浸润和肺泡上皮细胞损伤，甘氨酸预处理可抑制促炎因子的升高，包括TNF-α、干扰素和白细胞介素。在本研究中，一些代谢途径，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢被LPS破坏，FZJDF改善了失调，表明氨基酸代谢途径是肠肺串扰的关键因素（图10）和FZJDF的潜在靶点。
本研究介绍了一种利用FZJDF治疗ALI的新方法，并探讨了改善ALI的潜在机制，从而为其治疗提供了新的临床应用。我们强调了FZJDF作为一种药物或治疗策略的潜力，并提出了未来的研究方向，以进一步研究FZJDF预防ALI的内在机制，影响肠道微生物群和肺部之间的相互作用。
这项研究有一些局限性。我们无法确定任何特定的微生物群或代谢产物在FZJDF改善LPS诱导的ALI模型中的关键作用。同时，有必要在没有LPS激发的情况下对阴性对照组给予FZJDF，以检查其对肠道微生物群的影响。我们需要进一步的研究来确定FZJDF调节巨噬细胞极化和氨基酸代谢的确切分子机制。越来越多的证据表明，肺部微生物群在肺功能中起着至关重要的作用。本研究未分析肺部微生物群；因此，需要更多的研究来阐明肺部微生物群是否有助于ALI，以及肠道和肺部微生物群如何影响ALI患者的肺损伤程度。
结论
总之，在本研究中，FZJDF通过综合应用宏基因组测序技术和UHPLC-Q-TOF-MS代谢组学，通过肠肺串扰和氨基酸代谢对LPS诱导的小鼠ALI模型发挥了显著的保护作用，有助于全面理解综合性疾病的多系统之间联系。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37972468/
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