NBT | 合成生长素的缓慢释放诱导顽固性木本植物不定根的形成

通过茎枝诱导不定根(ARs)进行无性系繁殖是育种项目的必要步骤。由于生长素在器官发生中的核心作用，吲哚-3-丁酸经常被用作商业生根混合物的一部分，然而许多顽固性植物在这种处理下不会形成ARs。

近日来自以色列特拉维夫大学的Roy Weinstain教授课题组在Nature Biotechnology上发表了题为Slow release of a synthetic auxin induces formation of adventitious roots in recalcitrant woody plants的研究论文。作者描述了在大桉树插枝中合成生长素偶联物的重点文库的合成和筛选，并鉴定了4-氯苯氧乙酸- l-色氨酸- OMe是一些顽固性木本植物(包括苹果和爱尔兰坚果)不定根的有效促进剂。综合代谢和功能分析表明，这种活性是由于生长素4-氯苯氧乙酸的初始快速摄取和缓慢释放和清除导致生长素信号传导延长而产生的。这项工作强调了生物活性化合物缓释策略对更有效的植物生长调节的效用。

AR发育是一种可遗传的数量遗传性状，具有较高的可塑性，受多种内在因素和环境因素控制。特别是，它被证明是由一个复杂的植物激素串扰网络控制的，其中生长素信号在这个过程的每个步骤中都起着核心作用。据报道，在一些植物物种中，难根成熟插枝的内源吲哚-3-乙酸(IAA)水平低于易根幼枝，如大桉(Eucalyptus grandis)。形成层是ARs通常形成的组织。然而，其他植物在幼枝和成熟枝条中显示出相当的内源生长素水平，甚至在成熟的难根枝条中表现出更高的水平，但在成熟枝条中形成AR的能力明显受损，无论是否施用外源生长素。

虽然IAA是植物中最普遍的内源生长素，也是最早用于诱导AR形成的物质，但人们发现吲哚-3-丁酸(IBA)和1-萘乙酸(NAA)更有效，在过去的60年里，它们是大多数商业生根配方的主要成分。最初，IBA和NAA的功效增加归因于它们具有更高的耐光性，但最近的研究指出，与IAA相比，它们的代谢和运输差异是其功效的潜在来源。多年来，人们通过不同的方法来提高IBA的有效性，包括其与各种分子的偶联。然而，许多抗逆性植物对这些化合物的外源施用反应不佳，它们的无性繁殖仍然是一个重大挑战。

合成生长素偶联物的设计与筛选

为了建立合适的化学文库，作者选择了合成生长素4-氯苯氧乙酸(4- cpa)(1)、2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)(2)、2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸(2- dp)(3)和NAA(4)进行偶联（图1a,b）。前三种属苯氧酸家族，分别具有较强、中等和较弱的生长素活性，这是通过抑制朱黄Prosopis juliflora的根伸长来确定的。NAA属于芳香乙酸家族，常用于商业生根增强混合物中。利用成熟的大叶黄树扦插评估了偶联物和游离生长素(共43个化合物)的生根增强能力，大叶黄树在K-IBA浸泡1分钟后再生根的效率很低。IBA钾盐与农业“金标准”生根促进剂共轭物(100 μM)通过将切割基部浸泡1分钟或喷涂切割顶端部分来应用，可以单独处理，也可以与6,000 ppm K-IBA (24.9 mM)浸泡处理结合使用。然后将插枝在生根台中培养约1个月，然后进行检查。由于其疏水性，在水基溶液中应用高浓度的1q是具有挑战性的。作为替代方案，除了6,000 ppm的K-IBA外，我们还结合了喷雾和浸泡处理，每种处理分别以三种不同的浓度(20、50和100 μM)进行处理，以增加1q的应用浓度。引人注目的是，这种双重应用方法在20 μM和50 μM的1q下分别产生了66%和77%的AR感应效率(图1c)，比单独使用K-IBA高3倍。与K-IBA相比，这种效应伴随着每根切割形成的根数量相当，但明显更长(图1d,e)。综上所述，作者发现一个简单而短暂的人工合成生长素缀合物的应用显著增强了K-IBA对新生根再生的饱和效应，这对农业工业来说是一个关键的实践。

图1. 对难根扦插生根促进剂进行化学筛选。

4-CPA独特的生物利用度是1q活性的基础

作者推测1q通过两步过程发挥其生物活性，其中1q首先被水解成羧酸形式(1r)，然后去除氨基酸，从而释放出生物活性4-CPA(图2a)。为了排除1q本身可以与生长素感知机制相互作用，从而直接调节AR形成的可能性，我们在体外通过表面等离子体共振(SPR)测量来评估其影响TIR1-Aux /IAA7生长素感知复合物形成的能力。因此，1q的活性似乎取决于其释放生物活性4-CPA的能力。为了了解1q在植物中的命运，在4-CPA或1q浸泡后(外加K-IBA浸泡)，在处理后的8天内，通过HPLC-MS /MS定期分析切割碱基的小分子含量。图2c显示了应用1q后的代谢衍生物，图2d显示了应用1q或游离4-CPA后测量的4-CPA水平。第一个时间点，1h后应用，说明了1q的一个特征;羧酸的酯化反应导致更疏水的分子(在pH 7.0时计算logD: 0.06 vs . 3.17)，导致1q的摄取比游离4-CPA(图2d)高10倍(515.5±24.4 vs 53.2±5.6 pg mg−1鲜重(FW))。这个时间点也证明了1q在植物中的快速脱酯化，在测量的1q衍生形式中约有13%的1r，而4-CPA的量可以忽略不计，这表明酰胺键的裂解是4-CPA释放的限速步骤。事实上，施用6小时后，1q水平下降了82%(至90.9±4.1 pg mg−1 FW)，而1r和4-CPA水平分别为48.5±0.8和38.2±1.1 pg mg−1 FW)。这一观察结果表明，最初，1q的很大一部分不能用于立即去酯化。在随后的~48小时内，1q水平保持相对恒定，同时检测到1r明显转化为4-CPA。有趣的是，尽管与游离4-CPA相比，1q的摄取更高，但两种处理中4-CPA的最大水平是相当的(4-CPA或1q分别为53.2±4.0和72.0±2.0 pg mg−1 FW)(图2d)。然而，它们形成的时间却截然不同;4-CPA水平在释放后1小时达到峰值，而在24小时后达到峰值(图2d)。为了进一步评估这一点，我们转向拟南芥，首先寻求在这种模式植物中建立1q的活性，然后将其与生长素信号传导联系起来。与E. grandis的结果一致，短暂(1.5 h)施用1q，而不施用4-CPA或IBA (10 μM)，导致完整黄化拟南芥幼苗的AR形成大幅增加(图2e和补充图7)。同样，对拟南芥DR5:Luciferase line进行相同处理，编码适合长期成像的高周转率生长素报告基因64，与4-CPA相比，1q导致生长素信号传导更强，时间更长(图2f)。重要的是，这些观察结果还表明，K-IBA治疗不一定是1q活性的先决条件。综上所述，上述实验结果表明，1q作为生长素持续释放的储存库，促进AR的诱导和发育。

图2. 1q结合了高渗透和缓慢的4-CPA释放，以促进延长生长素信号传导。

1q促进远亲木本物种ARs的形成

实验结果表明，在不同的植物物种中，1q可以促进新生根再生，并保护其关键的激活酶，这激发了我们研究1q在缓解农业和环境上重要的难根品种的生根障碍方面的作用。作者首先研究了桉树(Eucalyptus x trabutii)，这是一种非常难以繁殖的桉树(E. camaldulensis)和botryoides的杂交品种，它具有相对较高的抗寒性，在以色列秋季期间对蜜蜂的营养至关重要。对于该杂交种，联合施用1q和K-IBA显著优于单独施用K-IBA的生根效率(45%比不施用K-IBA，图3a)。同样，对于苹果(Malus domestica)砧木无品系CG41，它具有高产、矮化和抗土壤病害的特点，但被认为难以生根，与单独使用K-IBA相比，补充1q可使生根率提高约2倍(图3b)。摩洛哥坚果树(Argania spinosa)以其对极端环境条件的耐受性和其宝贵的油而闻名，作为我们支持当地种植的努力的一部分，作者评估了几个无性系:三个难以生根的无性系(C124, C127和ARS7)，其中前两个是直接从1931年在以色列种植的第一批树中获得的。1q处理使>90年龄C127植株扦插生根率提高了一倍，但没有提高C124较低的生根效率(图3c)。对于ARS7, 1q再次使基根形成对K-IBA的反应增加了一倍，而对于更宽松的ARS1，两种处理都有最大的反应(图3c)。综上所述，这些结果表明，由于生长素敏感性低而导致再生率低的成熟木本扦插，IBA的饱和效应可以通过低水平的1q (μM范围)来增强。结果进一步表明，IBA的异位添加并不一定是成熟木本组织对1q的生根增强响应的先决条件。事实上，单独处理1q后，白杨扦插生根率提高了一倍(图3d)。

图3. 1q是一种强效的木本插枝生根促进剂。

综上所述，考虑到生根促进剂在许多农业、园艺和林业部门的广泛使用，1q能够显著提高多种商业相关、难根树木扦插的生根率，加上一种工业兼容的应用方法，表明其具有很高的商业成熟度。此外，本文所应用的缓释方法可以结合到其他农业实践中，其中生长素的应用不仅仅是作为除草剂，如调节根系复杂性，控制果实生长或果实结实的时间，以实现更优化的响应。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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