基因组重排是驱动生物进化的重要力量，也是导致多种疾病如癌症等复杂性疾病的关键因素。基因组重排包括缺失、重复、插入、倒位和易位等多种形式，可通过改变基因拷贝数、扰动蛋白质编码序列以及顺式调控网络来实现。前人研究表明，基因组重排普遍存在于从原核生物到人类的所有生命系统中，同时相较于碱基突变而言，基因组重排导致物种进化的速度高出好几个数量级。SCRaMbLE系统的植入是酵母基因组合成计划（Sc2.0）中的一个重要设计1，且已经被证实为一种有效造成酵母合成基因组组重排的方法，被应用于条件性耐受菌株开发、天然产物生产和基因组精简等多个研究领域2。然而由于目前含有全部合成染色体的酵母尚未构建成功，因此还不能实现在全基因组范围内的SCRaMbLE重排。此外，前期研究表明，以包含单条或多条合成型染色体的菌株进行SCRaMbLE重排时，单条染色体内的重排事件和多条染色体间的重排事件存在较大差异3,4，然而目前并没有一个研究染色体间重排的好的模型。
2024年1月26日，中国科学院深圳先进技术研究院戴俊彪团队在Nature Communications在线发表题为“Large-scale genomic rearrangements boost SCRaMbLE in Saccharomyces cerevisiae”的研究论文，通过CRISPR系统在酵母全基因组范围内引入数十个loxPsym位点，构建了可进行全染色体重排的酵母系统，为研究基因组结构变异对菌株环境适应性及在进化上的影响奠定了基础。研究发现大片段的结构变异能够引起基因转录水平和基因组3D结构的变化，进而产生对压力环境更耐受的表型；进一步研究发现，与包含合成型染色体菌株杂交后，引入众多loxPsym位点后的杂合二倍体菌株在乙酸条件下表现出比只包含合成型染色体的二倍体菌株更快的适应性进化速度。
在该工作中，研究人员首先利用CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母的16条染色体上分散的插入了83个loxPsym位点，其中每条染色体至少包含2个位点。他们将这个工程菌株命名为SparLox83，并确认了83个loxPsym位点的插入不影响菌株的生长和基因组稳定性。
为了提高对重排菌株的筛选效率，随后研究人员在SparLox83菌株中引入了之前报道的重排菌株筛选系统——ReSCuES系统5，获得了工程菌株SparLox83R。同时，由于SparLox83R中每两个loxPsym位点之间一定存在必需基因，删除将会导致菌株致死，因此研究人员将SparLox83R和野生型菌株BY4742进行杂交，形成杂合二倍体。SparLox83R及其与野生型的杂合二倍体在五轮SCRaMbLE后，研究人员发现单倍体细胞的重排率（约30%）显著高于杂合二倍体（约3%），而且在两种基因型的混合细胞中，染色体间重排事件都多于染色体内的重排事件，这一结果不同于之前以合成型染色体为SCRaMbLE对象的研究。同时，研究人员发现不同的loxPsym位点之间重排频率差异较大，通过对变化的定量分析，最终发现了两个位点之间的距离以及染色质开放性等因素对重排频率的影响。
大片段重排可以驱动表型多样化和环境适应性，但在自然进化的菌株中，要区分大片段重排与其他类型突变对适应性的影响仍然具有挑战性。研究人员以SparLox83R为对象，诱导其进行重排，并在多种药物压力条件下筛选获得了耐受性增强的菌株。随后，研究人员对一株具有微管解聚药物耐受增强的菌株进行了测序以及转录组和空间三维基因组（Hi-C）分析，解析了四号染色体、九号染色体和十四号染色体的结构变异与耐药性的相关机制。
进而，为了探究分散排列的loxPsym位点介导的大片段重排是否可以提高合成型染色体的定向进化速度，研究人员将SparLox83R与含有合成型染色体的菌株杂交并诱导SCRaMbLE。测序发现，SparLox83R中分散排列的loxPsym位点可以与合成型染色体上的loxPsym位点一起产生多种类型的重排，不仅包括来自于合成型染色体和SparLox83R的结构变异，同时也会产生高频率的杂合性缺失和非整倍体现象。
为证实这些多种多样的重排能够为菌株进化提供驱动力，研究人员比较了两种不同的杂合二倍体菌株：SparLox83R和合成型三号染色体菌株杂交形成的二倍体（JDY544）以及野生型单倍体菌株和合成型三号染色体菌株杂交形成的二倍体（JDY546）在乙酸胁迫下的进化速度。通过对48个独立群体进行诱导重排以及乙酸平板上生长检测，发现经过三轮的进化，JDY544的48个群体都可以在高浓度的乙酸条件下（0.7%）生长，而JDY546仅有几个群体可以在该条件下生长。这一结果说明，与JDY546相比，来自于JDY544的群体能够更快的产生对乙酸耐受的菌株，暗示了SparLox83R中分散排列的loxPsym位点介导的重排可能与乙酸耐受性的快速增强有关。
综上所述，本研究成功构建了一个包含83个分布在16条染色体上的loxPsym位点的工程酵母菌株，并以此为研究对象，通过对SCRaMbLE之后所得菌株进行高通量测序及染色体结构分析，证明了带有全基因组分布loxPsym位点的酵母菌株可以作为研究基因组重排的有力工具，并且能够驱动菌株快速进化，获得环境胁迫耐受性。该研究提供的方法也为将SCRaMbLE系统应用到其他工程菌株或物种中提供思路，从而极大地拓展了SCRaMbLE系统的应用范围。
中国科学院深圳先进技术研究院助理研究员程莉、博士生赵世俊、博士后李天一和已毕业博士侯莎为论文共同第一作者。戴俊彪研究员为论文通讯作者。该研究获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省基础与应用基础研究基金、中国科学院大科学计划、深圳市科技计划、中国农业科学院创新计划项目及深圳合成生物学创新研究院等多个项目的支持。
参考文献：
1. Dymond, J. S. et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature 477, 471–476 (2011).
2. Steensels, J., Gorkovskiy, A. & Verstrepen, K. J. SCRaMbLEing to understand and exploit structural variation in genomes. Nat. Commun. 9, 9–11 (2018).
3. Zhang, H. et al. Systematic dissection of key factors governing recombination outcomes by GCE-SCRaMbLE. Nat. Commun. 13, 5836 (2022).
4. Zhou, S. et al. Dynamics of synthetic yeast chromosome evolution shaped by hierarchical chromatin organization. Natl. Sci. Rev. 10, (2023).
5. Luo, Z. et al. Identifying and characterizing SCRaMbLEd synthetic yeast using ReSCuES. Nat. Commun. 9, 1–10 (2018).
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