背景介绍
慢病毒属于逆转录病毒家族，重组慢病毒载体由人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）发展而来，广泛用于研究和临床。最新的第三代慢病毒载体只需要病毒基因组、gag、pol和包膜蛋白即可完成慢病毒包装。只要将病毒基因组和表达HIV gag、pol、vsv-g包膜和rev基因的包装质粒分离单独构成质粒，重组慢病毒的生物安全性将会得到提高。因此，只要感染的细胞表达gag、pol、env和rev，用重组慢病毒感染的哺乳动物细胞就几乎不会产生有感染性的病毒。
尽管提高重组慢病毒安全性的效果是成功的，但重组慢病毒的滴度较低仍然是一个技术问题。为了解决低滴度的问题，有前人提出引入tat转录因子可提高慢病毒滴度。然而，在Fujibayashi S等人的测试中，这只对提高天然5′LTR慢病毒的转录活性有效，而对CMV-5′LTR-hybrid启动子型慢病毒无效。
针对以上结果，Fujibayashi S等人提出假设，包装元件如GAG、POL、VSV-G和REV的表达量升高可能会增加重组慢病毒的滴度，即使是CMV-5′LTR-hybrid启动子型慢病毒也可得到相同的效果。2023年5月，Fujibayashi S等人在Analytical Biochemistry上发表了名为“Increased lentivirus titer using ultra expression vectors”的论文，该论文阐明了慢病毒包装如何利用超表达载体来提高病毒滴度的技术手段。
结果展示
01
研究者利用正常包装质粒、TAT包装质粒和Ultra包装质粒分别制备慢病毒，通过感染 HCT116 细胞后对嘌呤霉素产生的抗性集落数来测试慢病毒的滴度。未感染的细胞（Control）没有产生集落，而UItra包装质粒制备的重组慢病毒感染细胞后产生最多的抗性集落（图1A）。在六次重复中，对照组的平均集落数最低（0 cfu/mL），其次是正常组（4.95×105 cfu/mL）、TAT组（6.32×105 cfu/mL）和Ultra组（2.00×106 cfu/mL）。
结果表明，TAT和Ultra组慢病毒滴度明显高于正常组（图1B）。随后，研究者采用qPCR检测细胞中慢病毒携带的嘌呤霉素抗性基因的RNA水平。正常组只检测到68.3拷贝/μL，而Ultra组检测到145.8拷贝/μL（图1C）。以上研究表明Ultra包装质粒能够更高效地产生重组病毒。
图1. 从正常、TAT和超表达载体获得的慢病毒的生物学滴度。
A.嘌呤霉素抗性集落的集落形态；B.对嘌呤霉素选择的抗性集落数的平均误差和标准误差，统计显著性用**表示（p＜1%）；C.使用qPCR检测正常、TAT和超表达载体的初始拷贝数，包括一个排除逆转录酶（RT-）的阴性对照；D.在HEK293T哺乳动物细胞的细胞裂解物和上清液中用蛋白质印迹法检测慢病毒相关蛋白，使用环孢菌素A（CypA）作为对照。
为了评估HEK293T哺乳动物细胞和上清液中的蛋白质水平，研究者进行了WB检测。正如预期的那样，仅在TAT和Ultra组细胞裂解物和上清液中观察到HIV-TAT的表达，因为正常系统不包含任何TAT质粒（图1D）。在Ultra组的细胞裂解物和上清液中，检测到病毒成分之一p24的条带亮度略高。然而，在VSV-G的蛋白质表达水平上没有观察到显著的变化。
02
研究者进一步测试了在插入基因相对较长的情况下，超表达载体是否可以提高病毒滴度。研究者选择了CSII-CMV-CNROE，它编码直接重编程转录因子（CRX、RAX、NEURO-D和OTX2）和EGFP荧光标记。该载体的插入片段大小为4854bp，最初是作为光感受器细胞直接重编程的工具进行开发的。包装病毒后，计数EGFP阳性细胞核的百分比来反映病毒滴度。EGFP在TAT系统中的表达约为正常系统的1.3倍（正常：25.89% vs TAT：32.88%）。此外，超表达载体显示荧光表达水平为65.54%，比正常系统高2.53倍（图2A和B）。根据这一观察结果，研究者得出结论，即使在插入DNA相对较长的情况下，超表达载体也会增加滴度。
图2. CNROE（CRX、RAX、NEUROD、OTX2、EGFP）蛋白在原代人胚胎成纤维细胞HE16中表达的检测。
A.用荧光显微镜检测CNROE蛋白，对照组含有未被感染的细胞，合并的EGFP和DAPI图像显示在右侧；B.CNROE在不同系统中的感染效率，p＜1%水平的统计显著性用**表示。
讨论
慢病毒是一种高效的基因转移系统，广泛应用于基础科学。文章所述的慢病毒包装系统改进方法可以用于任何现有的慢病毒载体，并且有助于改进基因递送。
参考文献 |
Fujibayashi S, Kiyono T, Endo Y, et al. Increased lentivirus titer using ultra expression vectors[J]. Analytical Biochemistry, 2023, 669: 115119.
转自：“科研腔”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
