英文原题：Novel Substrate Prediction for the TAM Family of RTKs Using Phosphoproteomics and Structure-Based Modeling
供稿人：杨振霖 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Bio.的文章，题目是 “ Novel Substrate Prediction for the TAM Family of RTKs Using Phosphoproteomics and Structure-Based Modeling” 这篇文章来自于明尼苏达大学双城分校的Laurie L. Parker 教授。Laurie L. Parker教授课题组一直以来专注于酪氨酸激酶磷酸化等翻译后修饰的研究，在这篇文章中，Parker教授研究团队将目光投向了鲜有人研究的TAMs家族，使用了磷酸化蛋白质组学和Alphafold 结构预测的双重金钥匙，解析了TAMs家族的可能肽底物，为后续的激酶活性研究提供了重要保障。
各位读者对受体酪氨酸激酶应该都非常熟悉，很多热门药物靶点（诸如EGFR，HER2等等）都是受体酪氨酸激酶家族，在今天要介绍的这篇文章中，作者把目光投向了TAM家族上，主要包括三个RTK（Tyro3、Axl 和 Mer）。这个激酶家族在免疫抑制信号传导，细胞凋亡，吞噬等方面起到了重要作用。虽然说目前并没有把TAM家族列为致癌基因，但是这个家族确实与癌症的发生发展息息相关。TAM家族在多种实体瘤和血液瘤中都过表达，Axl激酶又与多种不同癌症的转移和迁移挂钩，但是对于TAM的研究仍然是一片蓝海，生物学家并没有对其投入太多的经历，在这篇文章中，作者就使用了他们课题组开发的底物预测工具，对TAM家族的底物进行了初步的解析和表征。
概括来讲（图1所示），作者首先利用了他们先前就发展的一个工作流程，第一步将细胞中的所有磷酸化位点去磷酸化，然后把我们要研究的目标TAM激酶加入其中进行磷酸化，之后使用二级质谱鉴定被磷酸化的肽段。将数据输入到作者之前所使用的KINATEST-ID V2.1.0 R语言程序中，就可以获得一系列候选肽矩阵，从矩阵中抽取评分比较高的一些肽，即可用作验证磷酸化。但是发现三种激酶还是存在一些差异性打分偏好，不好完全使用评分制进行解释，所以作者就使用Alphafold模拟了候选肽底物与TAM激酶结构的结合区域，与实验结果比较一致。接下来，我们仔细的研读一下这篇文章。
图1. 作者预测鉴定TAM激酶底物肽的工作流程
目前来讲，对TAMs激酶的研究比较有限，鉴定出来的只有26个磷酸化位点，第一步，作者为了确定TAM家族的底物，细胞被全部裂解，蛋白质组被完全还原后再烷基化，之后使用胰蛋白酶切割消化后，使用lambda去磷酸酶消除所有磷酸化的内源位点。第二步，作者使用TAM激酶对细胞进行刺激，然后将刺激过后的磷酸化肽段输入Orbitrap中，数据分析方面，作者使用了他们之前所使用的KINATEST-ID方法，简而言之，这个方法是为酪氨酸磷酸化位点周围的几个氨基酸创建一个PSSM，在三次重复后，作者找到了一系列可能的底物肽段。体外磷酸化实验表明，TAM三种激酶在底物谱上具有一定的相似性和差异度，在简单的生物统计分析之后，作者得到了热图（图2所示），比如说我们可以看出，如果我们以中心的酪氨酸设置为0点，那么可以看出所有激酶对于-3处的天冬氨酸都具有偏好性，作者最终选取了6个Tyro3 偏好序列，4个Axl偏好序列以及5个Mer偏好序列来进行后续的验证。
图2. ( A ) 在三次重复中TAM所共享的肽段以及独立拥有的底物肽段 ( B ) 基于Fisher Odds的分析的PSSM，基于酪氨酸为零点的映射和颜色编码，高于1的表示该区域的该氨基酸频繁出现编码序列，低于1的表示出现频率较低。
如表1所示，这些候选底物肽的评分范围在-4到+4之间波动，我们不妨首先看看Tyro3的磷酸化底物肽，因为作者观察到了Tyro3的磷酸化经常发现在N端的2-3位置的酪氨酸，所以作者以酪氨酸为中心，合理的前推了三个氨基酸，而没有更多的推移，之后，作者使用tyro3的预测底物肽段进行了磷酸化测定实验，使用了磷酸化的抗体，作者进行了ELISA化学发光读数来表征磷酸化的速率，从图3我们可以看出，所候选出来的6条肽均有被TAM磷酸化的信号，同时，作者也对Axl和Mer的候选肽进行了同样的测定，测定结果也初步证明了候选肽的磷酸化信号强度。
表1. TAM候选肽序列
之后，作者考虑到这种普遍的磷酸化ELISA不能反应单一位点的磷酸化，也不能反映磷酸化的选择偏好性，所以，为了深入了解每种底物的TAM选择性，作者评估了其他的激酶对于底物肽的磷酸化程度，所以作者对15种底物，分别用三种激酶进行了一锅法反应。用LC-MS检测底物的生成，作者使用磷酸化的面积进行定量，并且把面积/时间当作磷酸化效率。把这些所有的斜率，也就是磷酸化效率绘制在一张热图里（如图4所示）。从图中我们可以看出，Tyro3对于tyro3-A的磷酸化比率最高，这也和打分以及ELISA结果是类似的，我们也可以看出Mer对于Tyro3 E有一定程度的脱靶效应，同时我们可以看出Tyro3对Axl的底物也有很强的磷酸化效应，Mer也有对Axl底物肽的磷酸化，但是其本身的Axl对于Axl的底物似乎还没有其他的两个激酶好，这就对评分系统提出了挑战。
图4. 一锅法对15种候选肽进行选择性磷酸化测定
为了进一步进化这种底物预测筛选策略，作者决定将磷酸化蛋白质组学与结构导向的预测进行联用，结构导向的预测中，最著名的莫过于Alphafold，所以作者使用Alphafold对激酶的肽结合模型进行了预测，并且对模型进行了基础评估，激酶结构域必须处于活性构象，同时肽必须相对于激酶结构域有正确的定位。为了能够直观的观察催化活性，作者将其转化为二进制，只要大于0.0002就设置为1，在Alphafold方面，作者将同时满足活性构象并且正确定位的底物肽设置为1，从而得到了图5的结合图，我们可以看出，实验中得到的这个peptide是否是binder，和alphafold预测出来的具有非常强的同源性和相似度，证明了结构导向的方法可以帮助我们在磷酸化蛋白质组学的基础上再缩小范围，加强准确性，预测到底哪一条肽可以和激酶结合。
图5. 实验测定过的激酶活性和AF2预测的激酶结合具有高度同源性
在结合了Alphafold之后，预测的准确性被大大提高，所以作者还想进一步解释在最初的磷酸化蛋白质组学预测矩阵中的序列偏好性，对于每一种激酶，作者都对所有被预测是正确的肽进行了模型拟合，可以看出中心的酪氨酸激酶是完全重叠的，并且这些所有的肽从-2位置到+3位置实际上重合度都是很高的，但是再往外延伸就完全不同，这种不同被认为是因为残基不同导致出现了偏好性，精氨酸或者疏水残基的出现导致了有利的相互作用，从而导致了高评分。
图6. Alphafold预测的正确底物肽和激酶结构示意图
综上所述，作者采用了磷酸化蛋白质组学以及Alphafold辅助的结构预测两种方法，对TAM的可能底物肽进行了预测，合成，表征，我们其实可以看出，只凭借组学以及软件的打分方式并不完全精确，作者所提出的结构辅助的方法，确实很大程度上增强了预测的精确度，为未来提供了一种研究范式。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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