ACS Chem. Biol. | 基于核酸适体的RNA甲基化修饰活性传感器

英文原题：An RNA Methylation-Sensitive AIEgen-Aptamer Reporting System for Quantitatively Evaluating m6A Methylase and Demethylase Activities

通讯作者：刘建钊，曹婕 浙江大学

供稿人： 毕云鹏 北京大学

大家好，本期为大家介绍一篇发表在ACS Chemical Biology的文章，题目为“An RNA Methylation-Sensitive AIEgen-Aptamer Reporting System for Quantitatively Evaluating m6A Methylase and Demethylase Activities”，文章的通讯作者是来自浙江大学的刘建钊教授和曹婕博士。本文中，作者发展了一种基于聚集诱导发光（AIE）的核酸适体传感器，能够实现对N6-腺苷酸甲基化（m6A）修饰酶及去修饰酶活性的精准定量，并有望被应用于对m6A修饰相关酶的高通量抑制剂筛选等场景（图1）。

图1. 基于AIE效应的核酸适体传感器用于定量评估m6A修饰相关酶的活性

m6A作为真核生物RNA上最为丰富的化学修饰，其在多种生命过程中起到了重要的作用，而调控m6A修饰酶中，以METTL3-METTL14为核心的甲基化酶催化复合体能够识别mRNA上的特异性序列RRACH（R=A, G; H=A, C, U），而FTO，ALKBH5等去甲基化酶则能够特异性擦除m6A修饰。在现有的生物学工具中，仍缺乏能够快速、定量并高效检测m6A相关酶活性的工具。因而作者在本文中开发了一种针对m6A的生物传感器用于检测相关酶的活性。Z-HBC是一种C在与特定的核酸适体Peper的结合下便会发生AIE效应的小分子染料，且先前有研究报道了这一复合物晶体结构。作者受到启发，便通过在Pepper中引入能够被识别的RRACH序列，设计了在存在m6A修饰时能够增强与Z-HBC结合能力的核酸适体A-Pepper，并通过定量检测甲基化修饰或去甲基化修饰前后的荧光强度，从而得到含有甲基化修饰的核酸适体比例，并间接反映出修饰或去修饰过程中相关酶的活性（图2）。

图2. 基于小分子染料和核酸适体的荧光传感器用于检测m6A修饰相关酶的活性示意图。

首先，作者对小分子染料Z-HBC的光学性质进行了研究（图3）。结果表明，Z-HBC自身便是一种具有AIE效应的染料，在较高浓度的水溶液中，Z-HBC便会发生聚集并产生显著的荧光。因而，为了防止Z-HBC自身聚集产生的荧光影响后续实验，作者筛选并得到了较为适合用于后续传感器中的Z-HBC浓度。

图3. Z-HBC光学性质的研究。

随后，作者在体外合成了含有m6A修饰的核酸适体（m6A-Pepper），并对Z-HBC与两种核酸适体的结合性质进行了表征（图4）。得到的结果表明，与两种核酸适体的结合并不会改变Z-HBC的光学性质，其吸收与发射光谱均未产生明显的变化，且两种核酸适体的折叠能力也不会受到影响。而Z-HBC与m6A-Pepper结合后其荧光强度相比A-Pepper发生了增强，结合常数也有了变化。作者认为，这一结果的原因是含有甲基的m6A-Pepper能够与Z-HBC有着更强的疏水相互作用，从而使得二者的结合更为紧密。

图4. m6A-Pepper的体外合成以及Z-HBC与两种核酸适体的结合表征。

接下来，作者对m6A-Pepper中的m6A位点进行了验证（图5）。通过在A-Peppe的甲基化过程中引入非甲基的官能团，被修饰的腺苷酸位点经过化学处理后能够在逆转录的过程中被逆转录酶错误识别，从而引入其他核苷酸，随后通过高通量测序便可对产生突变的位点进行鉴定。而结果表明，发生突变的位点只存在于甲基化酶识别序列内会被甲基化的腺苷酸上，从而证明了m6A-Pepper内仅有单一且特定的位点会发生m6A修饰。

图5. m6A-Pepper中m6A-位点的标记与验证。

最后，作者将这一开发的工具应用于了对m6A修饰相关酶的活性检测（图6）。结果表明，m6A的修饰比率与所检测到的荧光强度间有着良好的线性关系。对于甲基化酶METTL3和METTL14，通过作者开发的传感器检测得到的酶活与通过质谱检测得到的酶活结果基本一致，也能够对抑制剂处理下的METTL3酶活进行检测。而对去甲基化酶FTO，传感器也能对其酶活进行检测，并得到与质谱检测相近的结果。

图6. 基于核酸适体传感器的m6A修饰相关酶的活性检测。

总而言之，本文中作者开发了一种基于AIE的核酸适体传感器，具有相比于质谱等已有工具更为简单的操作流程，且能够实现与质谱效果相近的高精度m6A修饰相关酶的酶活检测。而在未来，除了拓展对其他修饰的检测工具外，这一工具同时也有望被用于检测m6A与其识别蛋白间的亲和力等场景。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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