来源 | 丁香学术
近年来，免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）给癌症患者带来了新希望。已被批准用于黑色素瘤、肾癌、头颈癌、膀胱癌等多种肿瘤的临床治疗，在肺癌治疗中更是取得突破性进展，是目前最常用的免疫治疗方案。然而，只有少数患者对免疫疗法有持久的反应，其原发性耐药仍然是主要障碍。
肠道微生物组已成为塑造肿瘤免疫监视和增强 ICI 疗效的关键因素。卡姆果（Camu-camu，CC），也叫巴西莓，是一种亚马逊浆果，含有丰富的维生素 C、花青素类物质，已被证明可以通过增加肠道中嗜粘液杆菌（A.muciniphila）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的丰度，对小鼠的肥胖和相关代谢紊乱发挥保护性作用。
近日，来自加拿大蒙特利尔大学研究中心的 Bertrand Routy 团队在 Cancer Discovery 期刊发表了题为：A natural polyphenol exerts antitumor activity and circumvents anti-PD-1 resistance through effects on the gut microbiota 的研究性论文。
该研究发现，卡姆果可改变肠道菌群组成，增强抗肿瘤活性和抗 PD-1 应答。同时发现，卡姆果中富含的栗木鞣花素（castalagin），是其发挥抗肿瘤功效的主要生物活性分子。
卡姆果的抗肿瘤活性依赖于微生物组
并规避 anti-PD-1 耐药性
为了评估卡姆果口服补充剂的抗肿瘤效果，接种 MCA-205 肉瘤（ICI 敏感）的小鼠每天接受卡姆果（CC）口服灌胃，并每 3 天腹腔注射抗 PD-1 或抗 PD-1 的对照（IsoPD-1）。结果发现，与水/IsoPD-1 相比，CC/IsoPD-1 和水/PD-1 的治疗效果相似，而 CC 和 PD-1 的组合可以进一步抑制肿瘤生长。
在此基础上，研究者进一步检测了 CC 的抗肿瘤作用是否取决于肠道微生物群。在小鼠接种 MCA-205 肉瘤后的 14 天内，他们使用来自用或者不用 CC 治疗的小鼠粪便样本对无菌小鼠进行粪便微生物群移植（FMT），发现只有来自 CC 处理后的小鼠粪便移植可以进一步改善了 PD-1 活性。这些实验表明 CC 的抗肿瘤活性是具有微生物依赖性的。
卡姆果增加了微生物组的多样性
并有益地改变了微生物组的组成
为了阐明卡姆果对肠道微生物组组成的影响，研究者在用 CC 治疗的 MCA-205 小鼠模型中表征了微生物群组成。与水/IsoPD-1 相比，CC 治疗组中，α 多样性增加。差异丰度分析表明，与对照组相比，CC 组中的瘤胃球菌属水平的比例更高。
同时，在 E0771 肿瘤模型中使用 16S rRNA 测序对肠道微生物组进行分析显示，与水/PD-1 对照组相比，在 CC/PD-1 处理组小鼠中，瘤胃球菌科 UBA1819、Turicibacter、Parasutterella、Ruminococcus、A. muciniphila 以及 Christensenellaceae R-7 和 Oscillospiraceae UCG-005 均有所增加。总之，这些结果表明，CC 诱导了肠道微生物群组成的变化。
卡姆果的抗肿瘤活性依赖于 CD8+ T 细胞并与免疫原性细菌种类相关
接下来，研究者通过流式细胞术，在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）内，表征 CC 的免疫增强作用。
在没有进行粪便微生物群移植的 MCA-205 模型中，分析显示与水/IsoPD-1 相比，在显示抗肿瘤活性的三组处理（CC/IsoPD-1、CC/PD-1 或水/PD-1）中，CD8+/Foxp3+CD4+T 细胞增加。研究者进一步检测了 TIL 的亚群，发现与水/IsoPD-1 相比，CC/IsoPD-1 增加了中央记忆 CD8+ T 细胞的比例。
为了验证与 CC 相关的抗肿瘤活性是由 CD8+ T 细胞介导的，研究者在 MCA-205 小鼠中，施用抗 CD8+单克隆抗体以消耗 CD8+ T 细胞亚群，同时结合 CC 口服灌胃。结果显示，与 CC/IsoCD8+（对照）相比，使用 CC 和抗 CD8+单克隆抗体的小鼠肿瘤生长增加，表明 CC 的微生物组介导的作用是具有 CD8+ T 细胞依赖性的。
卡姆果中的多酚物质 Castalagin，具有抗肿瘤作用
接下来，研究了卡姆果的微生物组依赖性抗肿瘤活性的生物活性分子。使用高效液相色谱（HPLC），根据其分子极性从 CC 中分离出原始提取物，发现栗木鞣花素（castalagin）与 CC 的抗肿瘤作用相关。在 MCA-205 和 E0711 小鼠肿瘤模型中，单独使用栗木鞣花素（castalagin），或与 PD-1 组合使用时，均获得了类似的肿瘤抑制作用。
接下来，研究者通过 MCA-205 模型中的 16S rRNA 微生物组，分析了 castalagin 对 SPF 小鼠微生物组的影响。分析结果表明，castalagin 导致了 Ruminococcaceae UBA1819、A. muciniphila、Ruminococcus、Blautia 和 Alistipes 的富集。
Castalagin 的全身免疫作用是 CD8+ T 细胞依赖性的
接下来，研究者检查了 castalagin 是否也可以重现 CC 的全身免疫反应。
首先，MCA-205 小鼠中的实验证实，castalagin 上调小鼠 TIL 中的 TCM CD8+ T 细胞。其次，肿瘤的免疫荧光染色进一步表明，与水/IsoPD-1 相比，castalagin/IsoPD-1 组中 CD8+/CD4+Foxp3+T 细胞的比例增加。
再次，通过 RNA 测序进行肿瘤转录组分析，观察到与水/IsoPD-1 对照组相比，castalagin/IsoPD-1 组中的相关基因通路上调，包括抗原加工和呈递、T 细胞受体信号通路以及 NF-kappa B 信号通路与发炎的肿瘤微环境相关。
最后，研究者观察到，castalagin 组小鼠引流淋巴结中 CFSElow CD8+ T 细胞的比例低于对照组，相应的杀伤百分比更高，这同样表明了 castalagin 的 CD8+ T 细胞依赖性机制。
Castalagin 可以规避抗 PD-1 耐药性
研究者使用来自 4 名 ATB 治疗（服用抗生素并接受免疫治疗）的非小细胞肺癌 NR 患者的粪便，移植到无菌小鼠中，在粪便移植后测试了 castalagin 的治疗效果。
结果显示，单独使用 castalagin 能够发挥抗肿瘤活性，还可以促进对抗 PD-1 治疗的响应。使用 16S rRNA 对粪便移植实验的粪便样本进行分析，与水对照组相比，castalagin 处理增加了 Ruminococcus、Alistipes、Christensenellaceae R-7 组和 Paraprevotella 的相对丰度，而 Lachnosclostridium 减少。
Castalagin 与布氏瘤胃球菌结合并促进抗肿瘤反应
在肠道中，castalagin 被水解成柑花素和鞣花酸，而鞣花酸又被肠道细菌进一步转化为尿石素。但在肿瘤小鼠模型中，使用其异构体 vescalagin 或其下游代谢物柑花素、鞣花酸和尿石素均未观察到抗肿瘤作用。这一结果表明，肠道细菌对 castalagin 的代谢可能是微生物群组成转变所必需的。
对 castalagin 进行荧光标记，并使用荧光显微镜观察，发现 castalagin 虽没有被布氏瘤胃球菌内化，但仍与细胞包膜相关。并且研究人员进一步发现，在 MCA-205 肿瘤的无菌小鼠模型中，布氏瘤胃球菌或 castalagin 单独的口服补充剂都没有效果，而两者的组合显示出抗肿瘤活性。
总结
本研究首次表明，从卡姆果中分离出的多酚物质 castalagin，可以通过与有益的肠道细菌布氏瘤胃球菌结合，发挥抗肿瘤作用。此外，在临床前 ICI 耐药模型中，使用 castalagin 可以重新建立抗 PD-1 的功效，促进了抗癌反应。
这些研究结果为未来在癌症患者中使用 castalagin 作为免疫检查点抑制剂药物的补充这项临床试验铺平了道路，为提高和延长免疫疗法的功效提供了新的策略。
论文链接：
https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-21-0808
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