2024年1月11日，中国农科院植保所周焕斌团队在Plant Communications发表了题为LbCas12a nuclease-mediated tiling deletion for large-scale targeted editing of non-coding regions in rice的研究论文。该研究提出了CRISPR/LbCas12a核酸酶介导的内源基因调控元件人工进化策略(LbCas12a nuclease-mediated tiling deletion, NTD)，并以水稻株高基因SD1调控区为靶标对该策略进行概念验证。
https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100815
基因的时空表达对生长、发育和应激反应至关重要，也受到可能位于启动子、内含子等基因组非编码调控区域的精确调控。迄今为止，大量的自然或诱变的非编码区变异已被报道为作物驯化和育种做出了贡献。编辑非编码区从而实现的基因表达微调可能会导致数量性状变异，能从数量性状变异群体中筛选农艺性状搭配更加平衡的组合，非常适合作物改良。
目前应用于编辑内源基因非编码区的技术主要是CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术。然而，与Cas9相比，LbCas12a倾向于识别TTTV的PAM基序，并在植物细胞中诱导更大的缺失。由于在水稻内源基因非编码区中富集A-T核苷酸和高重复性序列，LbCas12a介导的NTD技术更利于编辑非编码区的调控元件，更适合用于非编码区基因工程改造。
研究人员根据NTD原理，对绿色革命基因SD1的启动子，内含子，终止子等非编码区进行饱和覆盖，设计并构建crRNA文库以进行大规模打靶。通过农杆菌转化法对非编码区进行打靶，共筛选并鉴定到255个T0突变体，在不同的非编码区均能实现有效的覆盖编辑，突变类型以6-15bp的缺失为主。在T1代中也成功筛选鉴定获得6个在株高上呈数量性状变化的材料，进一步分析T2代表型、表达量水平、T-DNA分离确定这些数量性状变异是由非编码区编辑造成的，其中有4个变异位点在水稻4726个自然群体重测序数据中均未被检测到。综上表明，NTD技术能有效创制带有数量性状突变群体和对非编码区等位基因进行调控元件的筛选和创制。
NTD技术的提出和在水稻上的成功应用，预示了未来可对农作物各关键性状相关基因进行表达量微调，发掘出最优化的农艺性状组合。由此，各农作物的各农艺性状，如株高、株型、抗病抗虫等，均可以进行表达调控定制。NTD技术与团队前期报道的植物内源基因定向进化技术（BEMGE）互为补充，有望成为未来农作物精准分子育种的关键工具。另外，NTD技术的应用，亦可推动现代分子生物学基因功能调控机制的研究，帮助人们更加深入了解基因表达调控的奥秘，并可进一步运用到分子育种。
中国农科院植保所海南专项博士研究生马桂根、严芳副研究员、任斌副研究员为本文共同第一作者，中国农科院植保所周焕斌研究员为本文通讯作者，团队多名成员共同合作完成，中国农科院植保所周雪平教授、北京农林科学院李少芳研究员、河南农业大学农学院王道文研究员也参与了研究工作，该研究得到了国家自然基金、科技创新2030、海南崖州湾种子实验室、中国农科院“青年创新专项”、山东省重点研发计划和中国农科院创新工程等项目的资助。
参考文献：
Ma G, Yan F, Ren B, Lu Z, Xu H, Wu F, Li S, Wang D, Zhou X, Zhou H. LbCas12a nuclease-mediated tiling deletion for large-scale targeted editing of non-coding regions in rice. Plant Communi. 2024, doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100815.
Kuang Y, Li S, Ren B, Yan F, Spetz C, Li X, Zhou X, Zhou H. Base-editing-mediated artificial evolution of OsALS1 in planta to develop novel herbicide-tolerant rice germplasms. Mol Plant. 2020, 13(4):565-572.
图文来源：MPlant植物科学公众号
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
