今天给大家分享一篇癌症免疫治疗方向的最新研究成果。文章主要以探索如何提高NK细胞对癌细胞杀伤力为主线而展开的研究。今天主要分享本篇文章中的NK细胞诱导癌细胞线粒体凋亡的机制。
2022年4月28日，来自美国Dana-Farber癌症研究所在cell上发表了题为"Augmenting NK cell-based immunotherapy by targeting mitochondrial apoptosis"的研究性论文，研究成果揭示了一种可增强NK免疫疗法的新策略，此方法可能也适用于T细胞免疫疗法。
自然杀伤 (NK) 细胞和 CD8+ 细胞毒性 T 细胞是两种类型的免疫细胞，它们可以通过类似的细胞毒性机制杀死靶细胞。其中NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。其特征在于能够自发检测、识别并杀死被感染或恶性细胞（癌细胞等）。与T细胞相比，NK细胞还具有杀死具有低突变负荷/缺乏新抗原呈递的癌细胞。
目前，基于NK细胞的治疗主要以：CAR-NK、同种异体NK细胞过继转移治疗等。其中过继性NK细胞移植安全性高，发生移植物抗宿主病或细胞因子释放综合征（CRS）的风险低。此外，众多早期临床实验也表明：NK免疫疗法是一种安全性、可行性较高且有前途的治疗策略，尤其在血癌类治疗中更为显著。
如今，为了增强NK细胞的治疗效果，大多数当前的研究都围绕着两个焦点：（1）优化NK细胞来源（2）改善Nk细胞在体内功能和持久性。本篇文章内容，作者主要基于第二种焦点，探索如何提高NK细胞对癌细胞的杀伤性。因此，在探索过程中意外发现，线粒体凋亡（mtApoptosis）在NK介导的杀伤中起着至关重要的作用。由此，才有了下面一系列的好奇和探索。
来源：DOI: 10.1016/j.cell.2022.03.030
现在进入主题，讲解下文章中NK细胞诱导癌细胞线粒体凋亡的思路和成果：
第一部分：NK细胞诱导癌细胞线粒体凋亡（现象观察与机制探讨）
NK细胞和T细胞可以通过传递颗粒酶或利用死亡配体来触发癌细胞凋亡。颗粒酶途径主要通过诱导jurkat 细胞线粒体释放细胞色素c。但是，在较低的E-T（效应细胞-靶细胞）比例下，NK细胞介导的杀伤多大程度上依赖线粒体凋亡机制？
(1) 为了解决上述的疑虑，作者以OCL-AML3（难治性白血病细胞系）作为血癌代表、以HeLa宫颈癌细胞系代表实体瘤（靶细胞）；以健康供体分离出原代NK细胞（预激活处理）作为效应细胞。随后，设置不同E:T比例和时间点，将CFSE标记的癌细胞和预激活的NK细胞共培养。
CMXRos染色结果发现，预激活NK细胞诱导线粒体外膜电位丧失并让其释放细胞色素C，同时诱导BID、caspase-9、-8、-3 和 PARP-1 的裂解并导致靶细胞起泡和形成凋亡小体，这典型的细胞凋亡形态特征，都证明了NK细胞可诱导mtApoptosis。更重要的是，无论是在实体瘤还是血瘤实验测试中，均能检测到mtApoptosis且灵敏度很高。
结论：这表明诱导 mtApoptosis 可能是 NK细胞介导杀伤的一种重要机制。
来源：DOI: 10.1016/j.cell.2022.03.030
(2) 在过去的十年中，已经发现的几种其他形式的细胞程序性死亡：坏死性凋亡、铁死亡和细胞焦亡。那么，NK细胞介导的癌细胞杀伤性是否由其他类型细胞死亡参与？因此，作者在预处理的癌细胞中依次添加坏死性凋亡抑制剂/铁死亡抑制剂/焦亡抑制剂等处理，并观察NK细胞的杀伤性，结果发现：NK细胞的杀伤性未受到影响。相反，添加caspase-3 抑制剂 zDEVD-fmk 或泛 caspase 抑制剂 zVAD-fmk 显著降低了 NK细胞对癌细胞的杀伤性。
结论：NK细胞对癌细胞的杀伤主要由线粒体凋亡主导，不涉及其他程序性细胞死亡参与。
(3) 接着，为了研究细胞间接触是否影响NK细胞介导的杀伤？作者通过干扰细胞毒性细胞与靶细胞接触的Ca2+ 螯合剂 EGTA，结果发现完全消除NK诱导的细胞死亡。
结论：这表明 NK 杀伤需要细胞-细胞接触。
(4) NK 细胞可以传递颗粒酶或使用死亡配体与靶细胞结合并启动 mtApoptosis。经过使用死亡配体的中和抗体处理，结果发现，死亡配体有助于NK细胞杀伤但程度有限。此外，通过敲除死亡配体信号传导下游主要效应蛋白（caspase-8）进一步验证，结果表明，死亡配体在NK杀伤中未能发挥重要作用。相反，一系列的颗粒酶B敲低和靶细胞中的BID敲低实验，充分表明：NK 细胞主要通过传递颗粒酶诱导靶细胞中的 BID 裂解和细胞色素 c 释放，从而起到杀伤作用。
结论：NK 细胞通过传递颗粒酶诱导靶细胞中的 BID 裂解和细胞色素 c 起到杀伤作用。
来源：DOI: 10.1016/j.cell.2022.03.030
第二部分：较低的E:T比率<1时, mtApoptosis 机制对高NK杀伤性至关重要
(1) 为了探讨有效的NK细胞杀伤是否存在mtApoptosis 机制？作者通过BAX/BAK（BAX 和 BAK 是 mtApoptosis 所必需的线粒体外膜透化所必需）双敲除 (DKO) 细胞作为研究对象，BIM 肽（抑制所有抗凋亡蛋白）可诱导对照（WT）线粒体释放细胞色素 c，但DKO线粒体不受其影响。接下来，接种 HeLa WT 或 DKO 细胞，然后按照 E:T=1:2比率添加 NK 细胞，结果发现：相对于对照组，DKO 细胞组仅观察到极少数量的细胞凋亡。
来源：DOI: 10.1016/j.cell.2022.03.030
(2) 为了探讨E:T比率对 NK介导的杀伤的影响？经过一系列的对比实验发现，较低的E:T比率下, mtApoptosis 机制对于NK杀伤是必不可少的。接下来，作者选择一对B淋巴瘤细胞系（SU-DHL6 ：具有完整的 mtApoptosis 机制；BBDL不表达 BAX 和 BAK，不可启动 mtApoptosis 机制）作为研究对象，选择不同杀伤能力NK细胞进行实验，结果发现：当E:T =1:2 时，无论是杀伤力强还是弱的NK细胞，均未能有效杀死 BBDL 细胞，相反，E:T = 2:1 时，高杀伤性NK细胞能够规避线粒体缺陷并有效杀死 BBDL 细胞。
结论：较低的E:T比率<1时, mtApoptosis 机制是NK细胞杀伤必不可少，但高E:T比率条件下，NK细胞可规避 mtApoptosis 机制起到杀伤作用。
转自：“中北科研”微信公众号
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