清华大学药学院刘刚课题组发表了新型结核分枝杆菌单细胞荧光诊断试剂的研究结果

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近期，清华大学药学院刘刚教授课题组在美国化学会杂志Analytical Chemistry发表了新型结核分枝杆菌单细胞荧光诊断试剂的研究结果，题目：From Bench to Clinic: A Nitroreductase Rv3368c-Responsive Cyanine-Based Probe for the Specific Detection of Live Mycobacterium Tuberculosis，已于2024年1月8日上线（https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04293）。该项研究由洪小巧博士生、耿鹏飞博士生和北京胸科医院田娜博士生等共同完成，并得到了首都医科大学北京胸科医院孙照刚博士的支持。

研究现状：

结核病是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 引起的传染病，其特点是死亡率高，低诊断率。根据世界卫生组织的统计，2021年，全球预计有1060万人患上结核病，但仅有640万人被确诊为结核病，结核病的诊断是结核防疫中最薄弱的一环。使用auramine O (AO) 或Ziehl-Nielsen痰涂片镜检是结核高负担国家的一线诊断方法，然而，AO和Ziehl-Nielsen都与Mtb细胞壁中的分枝菌酸结合，不能区分活菌和死菌，不能反映结核病患者服药后的治疗效果，容易导致耐药菌的产生。此外，AO的染色步骤繁琐，易受临床样本中的食物残渣、杂蛋白等自发荧光干扰、抗淬灭能力差，临床迫切需要开发新一代光稳定性强的荧光探针，用于快速、简便地标记Mtb。由于临床痰液样本中存在不同的菌种和复杂的成分，对荧光探针的化学结构稳定性、光学稳定性、特异性以及样本处理稳定性等多方面均有较高的要求，虽然目前已报道了多种Mtb新型荧光探针，但多停留在实验室水平。

硝基还原酶Rv3368c是花菁系列荧光探针的作用靶点：

本研究设计合成了一系列的花菁类荧光探针，并确定荧光强度最高的Cy3-NO2-tre为最终荧光试剂。Cy3-NO2-tre自身不发光，但在细菌内可被特异的硝基还原酶Rv3368c还原后开启荧光。Cy3-NO2-tre可以选择性标记不同种属混合菌中的Mtb，而不会对其他的细菌产生荧光标记 (图1)。课题组采用Pull down 实验技术鉴定了Cy3-NO2-tre作用靶点—Rv3368c，并通过比较Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回补分枝杆菌菌株内、过表达Rv3368c大肠杆菌DE3的荧光强度得到验证 (图2)。基于NCBI的生物信息学分析结果表明，Rv3368c主要表达于结核分枝杆菌科。

Cy3-NO2-tre跟踪Mtb与宿主细胞的相互作用：

Cy3-NO2-tre可以选择性标记宿主细胞内的Mtb，而不会对宿主细胞产生非特异性标记 (图3)。Cy3-NO2-tre响应较快、免清洗和灵敏度高的优点使其能够实时检测Mtb感染宿主细胞的全过程。课题组利用Cy3-NO2-tre成功地观察到宿主细胞伸出伪足捕获Mtb的过程，同时也发现某些细菌能够成功逃脱宿主细胞伪足的“抓捕”，为进一步研究宿主细胞和Mtb的相互作用提供了工具分子。

Cy3-NO2-tre用于结核病诊断和监测患者抗结核治疗效果：

课题组采用Cy3-NO2-tre检测了临床痰液样本中的活Mtb。与AO相比，Cy3-NO2-tre表现出显著更强的荧光抗淬灭能力 (图4)。基于Cy3-NO2-tre只标记活菌的特性，课题组将其与AO联用，初步研究了监测结核患者的抗结核药物的治疗效果。通常，结核患者需要服药三个月后再通过CT复查判断该患者对治疗方案的敏感性。采用Cy3-NO2-tre监测患者药物治疗前与治疗一周后痰液中活/死菌比例的变化，初步研究了患者服药治疗3个月后的CT结果相关性(图5)，表明Cy3-NO2-tre有可能能够用于早期监测抗结核药物的治疗效果，大规模的临床样本研究正在进行中。

科学家小档案

刘刚，2005年教育部长江学者特聘教授，现为清华大学药学院终身教授，博士生导师，先后培养硕士、博士研究生、博士后60余人，从事药物化学及化学生物学研究及研发30余年，于2000年以“协和学者”特聘教授的身份回国后在中国医学科学院协和药物研究所组建了独立的课题组；于2011年始任清华大学百人教授，清华大学医学院副院长，负责筹建清华大学医学院药学系（现为药学院），并担任清华大学首任药学系主任。

来源：清华大学药学院

转自：“创新清华”微信公众号

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