Nature Genetics：张强锋/汪阳明/席建忠团队开发鉴定同源长非编码 RNA 的新方法

长非编码 RNA（lncRNA）的发现和表征是过去几十年分子生物学领域的重大进展。已有研究成果表明，lncRNA 在发育、肿瘤等多种生理和疾病过程中发挥调控作用 1-3，但目前绝大多数 lncRNA 的功能仍然未知。通过鉴定不同物种间同源的 lncRNA，可以筛选出在进化过程中保守的 lncRNA，这些 lncRNA 也更可能具备重要的功能。但是，由于 lncRNA 的序列保守性较低 4,5，传统的序列比对方式只能鉴定出极少的不同物种间同源的 lncRNA。例如，在斑马鱼和人类上万的 lncRNA 基因中，通过序列比对只能找到几十个序列保守的同源 lncRNA。因此，不管是从 lncRNA 的理论还是技术方面考虑，目前都亟需一种新的方法来鉴定不同物种之间的同源 lncRNA。

2024 年 1 月 9 日，清华大学张强锋、北京大学汪阳明、席建忠研究团队合作在 Nature Genetics 上发表题为 Computational prediction and experimental validation identify functionally conserved lncRNAs from zebrafish to human（计算预测和实验验证鉴定人类和斑马鱼之间功能保守的长非编码 RNA）的研究论文。

该工作开发了一套新的计算流程，在包括人类、小鼠、斑马鱼在内的 8 种脊椎动物中，鉴定保守的同源 lncRNA，工作同时开发了基于 CRISPR 的基因敲除和回补筛选系统，通过实验验证了所鉴定的同源 lncRNA 在不同物种中的保守功能，为该领域的研究提供了新的思路。

该团队开发了一套鉴定不同物种之间同源 lncRNA 的计算方法（lncHOME）。lncHOME 计算方法通过比较基因组和机器学习的人工智能方法，在 8 种脊椎动物中鉴定出了一类在不同物种中具有保守基因组位置及保守 RNA 结合蛋白（RBP）结合位点模式的 lncRNA（图 1）。这些不同物种中潜在同源的 lncRNA 被命名为 coPARSE-lncRNA（lncRNA with conserved genomic locations and patterns of RNA binding protein (RBP) binding sites）。

图 1. 鉴定不同物种之间同源 lncRNA 方法（lncHOME）的计算流程

lncHOME 计算方法鉴定了 570 个在斑马鱼中具有同源基因的人类 coPARSE-lncRNA，其中通过序列比对的方式仅仅只能鉴定出 17 个序列保守的同源 lncRNA。相比于非同源的 lncRNA，这些 coPARSE-lncRNA 基因富集了更多疾病相关突变，并且更倾向于在癌症组织中异常表达。这些发现说明 coPARSE-lncRNA 可能具有重要的生理功能。

接下来，该团队深入探究了所鉴定的同源 lncRNA 的功能保守性。首先，通过建立 CRISPR-Cas12a 介导的大片段基因敲除筛选系统，该团队鉴定出了 75 个能促进癌症细胞增殖的 coPARSE-lncRNA，其中 37 个在 HeLa 细胞中起重要作用。着该团队进一步开发了一个基于 CRISPR-Cas12a 的敲除和回补单步系统，应用该系统发现，通过回补预测的斑马鱼同源 lncRNA 片段，可以挽救其中 4 个人类 coPARSE-lncRNA 的敲除所导致的 HeLa 细胞增殖的缺陷。更有意思的是，在斑马鱼胚胎中敲低这四个斑马鱼的 coPARSE-lncRNA 会导致严重的胚胎发育延迟，而这些表型可以通过回补人类的同源 lncRNA 进行挽救。以上结果说明这些同源 lncRNA 具有很强的功能保守性。

lncHOME 算法得到的同源 lncRNA 具有保守的 RBP 结合位点模式。根据这一条件推测，coPARSE-lncRNA 具有相似的 RBP 结合图谱。针对其中两条 coPARSE-lncRNA，该团队通过 RNA 沉降结合质谱实验验证了这一假设。更重要的是，对于上面所描述的可以挽救细胞增殖或胚胎发育缺陷的同源 lncRNA 片段，如果突变其中某些 RBP（例如 NONO 和 IGF2BP2）的结合位点，所得到的新的片段无法起到挽救效果。这些突变实验证明了 RBP 结合位点对 coPARSE-lncRNA 的功能的重要性。

总而言之，该团队的研究提供了一个基于机器学习的计算分析方法，鉴定得到了一系列在脊椎动物中潜在同源的 lncRNA，并通过实验验证了同源 lncRNA 的功能保守性。这些 lncRNA 在进化过程中序列保守性逐渐消失，但是却保留着保守的 RBP 结合模式（图 2）。该工作极大地扩展了当前脊椎动物中保守的 lncRNA 库，为研究 lncRNA 的进化、功能及作用机制提供了新视角和新资源。

图 2. coPARSE-lncRNA 的进化以及功能机制模型

清华大学生命科学学院黄文泽博士、熊团林博士及北京大学未来技术学院赵雨亭博士为论文的共同第一作者。生命中心 PI 张强锋、北京大学未来技术学院的汪阳明教授和席建忠教授为论文的共同通讯作者。中国科学院动物研究所刘峰研究员、衡鉴博士、清华大学生命科学学院韩鸽博士、王鹏飞博士生、北京大学赵志华博士、李娟博士、石铭和汪家震博士生、吴怡霞为论文工作做出了重要贡献。

转自：“丁香学术”微信公众号

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