Pre-mRNA（前体 mRNA）剪接是去除非编码的内含子序列的重要步骤，是真核生物基因表达的关键环节。这一过程由剪接体参与完成，剪接体分为主要剪接体（major spliceosome）和次要剪接体（minor spliceosome）。其中，主要剪接体负责去除 99.5% 的内含子，而次要剪接体负责处理剩余的 0.5%。
剪接体的异常与许多疾病息息相关，主要是癌症和罕见病。在过去的研究中发现，大多数 RNA 剪接失调的已知癌症源性突变影响 SF3B1 的 HEAT 重复序列中的残基。这些突变绝大多数聚集在 SF3B1 的 RNA 通路上，SF3B1 在酵母中的同源物 Hsh155 的相应部分突变改变了其与 Prp5 的相互作用和分支位点（Branch site, BS）选择。
尽管已经了解到这些线索，但这些癌症突变如何干扰正常的剪接仍然是谜。要解决这些关键问题，就必须从结构上阐明导致剪接体 A 复合物形成的剪接体复合物中间体。
2024 年 1 月 9 日，西湖大学施一公团队和中国科学技术大学张晓峰团队合作在 Nature Structural & Molecular Biology 杂志上发表了题为：Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome 的最新研究。
在这项研究中，他们报告了人类 17S U2 snRNP 和剪接体 pre-A 复合体的高分辨率低温电子显微镜 (cryo-EM) 结构。基于结构的生化分析，研究团队提出了一个关于 BS 选择校对和 A 复合物组装的工作模型。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
由于 PRP5 是 U2 snRNP 的重要组成部分，研究团队使用 Flag 标记的 PRP5 来纯化内源性的人 17S U2 snRNP，并重建了平均分辨率为 2.5 Å的 17S U2 snRNP 电镜结构。
随后，为了富集中间剪接体复合物，研究团队使用了抑制剂 spliceostatin A（SSA），该抑制剂能够在 A 复合物形成之前阻止剪接。结果显示存在一个双叶状的剪接体复合体（pre-A 复合体），包括 U1 snRNPs 和 U2 snRNPs。最终重建的人 pre-A 复合体 U2 snRNP 区域的平均分辨率为 3.0Å。17S U2 snRNP 和 pre-A 复合体的 EM 图谱揭示了许多功能十分重要但以前未被识别的特征。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
通过对 PRP5 和 SF3B1 之间的界面进行原子建模，他们发现 PRP5 N 端的三个结构基序与 SF3B1 紧密结合，将 PRP5 与 U2 snRNP 连接。三个结构基序包括一个长螺旋 α1、一个 acidic loop 和一个螺旋 α2。
其中，PRP5-SF3B1 界面最显著的特征是 PRP5 acidic loop 结合在 SF3B1 的 RNA 通道中，这是 pre-mRNA 的多聚嘧啶区（polypyrimidine tract, PPT）在组装剪接体中的结合位置。PRP5 acidic loop 在 RNA 通道中的结合必须由组装的剪接体中 pre-mRNA 的 PPT 替换。由此，PRP5 可能起到阻止 RNA 通道在剪接体组装之前结合非特异性 RNA 的作用。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
人 pre-A 复合物呈双叶状结构，U2 snRNP 与 U1 snRNP 之间通过柔性连接。与 17S U2 snRNP 相比，pre-A 复合物中 U2 snRNA 的构象以及周围蛋白质由于与 pre-mRNA 的结合发生了显著重排。与其他靶向 SF3B1 的抑制剂一样，抑制剂 spliceostatin A（SSA）嵌入在 SF3B1 和 PHF5A 之间的铰链口袋中。
在组装的剪接体中，从延长的 U2–BS 双链中翻转出的 BPA（branch-point adenosine）被 SF3B1 和 PHF5A 之间的铰链口袋特异性识别。然而，在获得的 pre-A 复合体中，SSA 占据了铰链口袋，使得 BPA 无法进入。因此，BPA 周围的 4 个核苷酸只在组装的剪接体中与 U2 snRNP 形成双链，但在 pre-A 复合体中并没有观察到。这一分析强烈表明，BPA 识别和稳定的延长的的 U2-BS 双链的形成之间存在相互关联。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
在组装 A 复合物的过程中，17S U2 snRNP 通过与 SF1 的相互作用被带到 BS 附近。然而，由于 TAT-SF1 的保护作用，pre-mRNA 无法获得 BSL。在 ATP 结合和水解的驱动下，PRP5 可能会拉动 U2 snRNA 的 5 ' 端，解开双链 BSL，从而干扰其与 TAT-SF1 的相互作用。打开的 BSL 序列依次与 BS 配对，形成初始的 U2-BS 双工。在这种中间状态下，SF1 尚未与 BS 完全分离。
相反，它与初始的 U2–BS 双链一起与 SF3A3、SF3A2-ZnF 和 PRP5 的解螺旋酶结构域结合。DNAJC8 与 SF3B1 在铰链袋的另一侧特异性相互作用。虽然 PRP5 校对 BS 的机制仍不清楚，但这一 17S U2 snRNP 和 pre-A 复合体的结构表明，PRP5 通过竞争机制校对初始 U2-BS 双链。在 pre-A 复合体中，PRP5 的解旋酶结构域与初始的 U2-BS 双链紧密相互作用，而 PRP5 的 acidic loop 占据了 RNA 通路，使得 pre-mRNA 无法进入。包含最优 BS 的初始 U2-BS 双链不太可能被 PRP5 破坏稳定，从而使下游 PPT 和 3'SS 序列有更好的机会从 RNA 通道竞争 PRP5 的 acidic loop，最终导致 PRP5 解离。随着 PRP5 的释放，BPA 与铰链口袋对接，SF3B1 变成闭合构象。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
癌症相关的突变已在许多剪接体组分中被发现，特别是 SF3B1。这些突变聚集在 RNA 通路及其周围区域，与 SF3B1 上的 PRP5 结合位点重合。在 RNA 通路中，Asp781 在髓系发育不良综合症中发生了反复突变。Arg625、His662、Lys666 和 Lys700 均通过氢键与 acidic loop 直接相互作用，它们在髓系发育不良综合症和慢性淋巴细胞白血病中均有高频率突变。
为了探究这些突变的影响，研究团队进行了基于结构的生化分析。结果显示，与 WT SF3B1 相比，突变 K700E 导致 SF3B1 和 PRP5 的相对结合比率从 100% 降低到 64%。类似的，RNA 通道中的其他七种癌症衍生突变（E622R、R625D、H662D、K666E、K741E、G742D 和 D781 G）均对其与 WT PRP5 的相互作用产生负面影响。因此，这些 SF3B1 的突变影响了在酵母和人类中与 PRP5 的结合。与 RNA 通道中的突变相比，SF3B1 的 HR10-HR12 中的突变（影响与 PRP5-α1 的界面）对 SF3B1-PRP5 相互作用没有影响。这一结果支持 PRP5 的 acidic loop 的主导作用。总之，SF3B1 的癌症源性突变损害了其与 PRP5 的结合，并且进一步影响了 BS 校对，进而引发剪接异常，导致疾病的发生。
来源：Nature Structural & Molecular Biology
总结
在该研究中，报告了人源 17S U2 snRNP 复合物和剪接体 pre-A 复合物的高分辨率结构，揭示了剪接体进行分支位点选择、校正的分子机制。
PRP5 主要通过其 acidic loop 占据了 SF3B1 的 RNA 通道而锚定在 17S U2 snRNP 上，PRP5 的解旋酶结构域与 U2 snRNA 结合，U2 snRNA 的 BSL 被 TAT-SF1 屏蔽，无法与 BS 发生相互作用。在 pre-A 复合体中，形成一个初始的 U2-BS 双工，PRP5 的解旋酶结构域与 U2 snRNA 保持在一起，acidic loop 仍然占据 RNA 通道。此外，SF3B1 的癌症源性突变损害了其与 PRP5 的关联，从而影响 BS 校对。
综上，这些发现为剪切体的早期组装以及由 PRP5 介导的 BS 选择或校对过程提供了关键见解。
转自：“丁香学术”微信公众号
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