Nat Commun：清华大学孙前文团队揭示 DNA 引物酶促进转录复制间的竞争并影响基因组稳定性的新机制

转录和复制是生物体维持和传递遗传信息的重要事件，它们以同一套基因组为模板，因而常会发生转录-复制对撞，诱发 R-loop 积累和 DNA 断裂，导致基因组损伤。R-loop 是由杂合双链 RNA:DNA 和单链 DNA 组成的三链核酸结构，其过量积累会导致基因组不稳定，因此生物体进化出了一系列机制调控基因组内 R-loop 的水平。其中核糖核酸酶 RNase H 能够特异消化 RNA:DNA 杂合链中的 RNA，从而清除 R-loop，维持基因组稳定。

2024 年 1 月 2 日，生命中心孙前文实验室在《自然·通讯》(Nature Communications) 杂志上发表了题为「引物酶促进转录和复制在同一模板链上的竞争从而导致 DNA 损伤」(Primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in DNA damage) 的研究论文。该研究揭示了拟南芥叶绿体 DNA 复制引物酶促进叶绿体基因组的转录复制竞争和 R-loop 积累，从而诱发叶绿体基因组断裂的分子机制。

为进一步探究参与基因组稳定性和 R-loop 调控的新因子，孙前文实验室对 atrnh1c 突变体进行 EMS 诱变筛选，获得多个表型抑制突变体。其中 acs1（atrnh1c suppressor 1）突变体无论是叶片颜色，光合效率，以及叶绿体的数目和形态，与 atrnh1c 相比均有显著恢复（图 1a 和 b）。通过基因定位和功能验证鉴定到 ACS1 基因编码一个叶绿体和线粒体双向定位的引物酶 ATH（图 1c-f）。引物酶在 DNA 复制过程中合成小的 RNA 片段，引导合成新的 DNA 链。

图 1 叶绿体引物酶 ATH 点突变通过减弱其与 DNA 结合抑制 atrnh1c 突变体表型

在 acs1 突变体中，ATH 蛋白的一个跨物种间高度保守的氨基酸发生替换，导致蛋白与 DNA 模板的结合能力变弱，合成 RNA 引物以及介导 DNA 复制酶合成 DNA 的能力下降，从而减缓了转录-复制对撞和 R-loop 积累，使得 atrnh1c 突变体的表型缺陷发生一定程度的恢复（图 2a-c）。通过链特异性的 DNA 断裂测序发现，在叶绿体基因组中高转录复制对撞的 rDNA 区域，转录和后随链的复制在同一条 DNA 链上进行，这条链的转录本末端存在特异且较高程度的单链 DNA 断裂（图 2d 和 e）。通过构建叶绿体 DNA 复制酶 Pol1A 与 AtRNH1C 的双突材料 1cpol1a，进一步验证了减缓复制可以减轻转录-复制对撞和 R-loop 积累，从而维持基因组稳定，恢复 atrnh1c 突变表型。

图 2 ATH 点突变减少叶绿体基因组 R-loop 积累和转录-复制冲突

此外，作者发现超表达引物酶 ATH 会促进叶绿体基因组中 R-loop 过量积累，诱发 DNA 断裂，并引起植株产生新叶黄化的表型（图 3 a 和 b）；而通过基因编辑敲除 ATH 则会导致胚胎致死，胚胎发育停滞在球形胚期（图 3 c-f）。这些结果表明细胞器中的引物酶 ATH 对于拟南芥的正常生长发育不可或缺。

图 3 适当的 ATH 表达对于植物正常生长发育具有重要意义

综上，本研究通过筛选拟南芥叶绿体中高度积累 R-loop 的 atrnh1c 突变体的回复突变，揭示了引物酶在调控基因组转录复制对撞中的作用，对于研究其他物种中的 R-loop 和基因组稳定性的调控机制具有借鉴意义。同时，本研究也证实了拟南芥细胞器引物酶 ATH 的适当表达水平对于植物的生长发育的重要性。

清华大学生命科学学院博士后张卫峰为该论文第一作者，孙前文副教授为本文通讯作者，孙前文实验室已毕业博士生杨卓和已出站博士后王文杰也参与了该项研究。该工作得到国家自然科学基金、生命科学联合中心、中国博士后科学基金等经费的支持。

转自：“丁香学术”微信公众号

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