Nucleic Acids Res | 重庆医科大学谢国明教授团队在CRISPR/Cas12a性能调控研究中取得重要进展

成簇规律性间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）最初在细菌和古细菌中被发现，被认为是为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。其本质是一种由CRISPR转录出来的crRNA（CRISPR RNA）介导的核酸酶，可以对具有相应序列的噬菌体核酸进行切割。由于具有高度的可编程性和反应性，这项革命性的技术被2020年诺贝尔奖得主Jennifer Doudna教授比作“基因魔剪”。目前，CRISPR技术已广泛应用于基因编辑、细胞内成像、转录调控等领域。然而，随着应用范围的不断扩大，仅凭CRISPR/Cas的固有性能已不足以满足越来越多细分应用的多样化需求。在新的发展阶段，如何调控CRISPR/Cas的性能以更好地满足不同的需求逐渐成为研究的重点。重庆医科大学检验医学院谢国明教授团队致力于将核酸纳米纳米技术与CRISPR/Cas12a整合，实现CRISPR/Cas12a多种性能的灵活、可控调控。

2022年10月，谢国明教授团队在Nucleic Acids Research上发表题为“A PAM-free CRISPR/Cas12a ultra-specific activation mode based on toehold-mediated  strand displacement and branch migration”的研究。研究报道了一种基于TMSD和BM的无限制的新型CRISPR/Cas12a激活模式——Toehold activator（TOA）激活模式。这种模式提高了Cas12a系统的特异性，能够以简单灵活的方式调节反应，并且任何dsDNA都可以很容易地获得的toehold，不受目标序列环境的限制。这种将toehold介导的链置换与CRISPR技术结合的策略展现出巨大潜力。

在上述研究基础上，谢国明教授团队进行了进一步探索，近日，在Nucleic Acids Research上发表题为“Unmodificated stepless regulation of CRISPR/Cas12a multi-performance”研究论文。该研究开发一种无修饰的CRISPR/Cas12a多种性能无级调控策略，以更好满足不同领域对CRISPR/Cas性能日益多样化的需求。具体来说，这项研究在CRISPR/Cas12a体系中引入了基于TMSD的额外RNA附件（ERA）工具包，利用核酸纳米技术的强大可编程性，基于可定制的ERA工具箱，可实现对多种CRISPR/Cas12a特性的细粒度和可预测控制，消除了对Cas蛋白或crRNA组分进行修饰的需要。此外，作者还通过附加ERA实现了空间连续但时间隔离的CRISPR激活控制，从而克服了等温一锅法检测中CRISPR/Cas信号输出模块与扩增模块的互斥难题，进一步提高了等温一锅法检测的灵敏度和信噪比，展现了精细控制CRISPR性能的巨大潜力。

该研究在CRISPR/Cas12a体系中引入了基于TMSD的额外RNA附件（ERA）工具包，这些ERA不会激活Cas12a,但能与crRNA的部分space区域结合形成具有toehold的双链结构，让激活剂与crRNA的简单配对结合转变为由TMSD决定的有条件的反应（ERA作用等同于“protecter”）。通过附加不同长度，不同结构，不同错配的ERA能相应地改变ERA-crRNA复合物与激活剂反应的动力学和热力学，从而允许精确地控制Cas核酸酶的激活程度，进而允许掌控包括活性、速度、特异性、编程性、拓展性和灵敏度等多项性能。

文章模式图（图源自Nucleic Acids Research ）

此外，谢国明教授团队发现在ERA辅助的一锅法中，能够以toehold作为延迟激活Cas12a的遥控器，将INA和CRISPR程序自动地从时间上隔离，既能延迟Cas12a激活，争取扩增时长，又能保留一定的反切活性，抑制PER泄露，实现更佳的信噪比（S/N）。

这种无需改变原有的CRISPR体系的策略，不仅更通用、成本有利和生物安全，而且有潜力和已经构建的Cas或crRAN修改策略兼容，以实现更多样的组合控制。这项工作也并不局限于Cas12a，即使是面对Cas13等靶向RNA的CRISPR家族，也可以加入相应的外部DNA附件（EDA）以实现类似效果。

参考消息：

https://doi.org/10.1093/nar/gkad748

转自：“iNature”微信公众号

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