北京大学：通过化学辅助方法定量m6A和Ψ在转录组中的修饰

背景

核糖核酸 (RNA)是存在于活细胞和病毒中的重要生物分子，对遗传信息传递和基因表达调控至关重要。RNA分子由4个核苷酸组成：腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鸟嘌呤 (G)和尿嘧啶 (U)。除了经典的核苷酸，RNA还可以经历不同的化学修饰，这些修饰作为额外的调控复杂性层对基因表达进行微调。自1951年发现第一个RNA修饰假尿苷 (Ψ，即第五核苷酸)以来，已经在RNA中发现了170多种不同的化学修饰。RNA修饰广泛分布于各种类型的RNA中，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和mRNA。2011年，N6 -甲基腺苷 (m6A) mRNA修饰具有可逆性和动态性。m6A最初于1974年被发现，但其去甲基化酶FTO和ALKBH5分别于2011年和2013年被报道，这使人们重新关注RNA修饰，尤其是mRNA修饰。迄今为止，与著名的5 '帽结构涉及的一个N7-甲基鸟苷 (m7G)帽与三磷酸链接器5 ' mRNA之外，在mRNA中已经发现了大约10种RNA修饰类型，包括m6A，Ψ，m7G，N6、2' -O-二甲基腺苷 (m6Am) N1-甲基腺苷 (m1A)，肌苷 (I)，5-甲基胞嘧啶 (m5C), 5-羟甲基胞嘧啶 (hm5C), 2 ' -O-甲基化 (Nm)和N4-acetylcytidine (ac4C) (图1)。近年来的许多研究表明，mRNA的修饰在基因表达调控中起着至关重要的作用，如mRNA的稳定性、剪接、翻译效率和RNA定位等。

简介    

2023年10月18日，来自中国北京大学的Meiling Zhang及其团队在Acc Chem Res (IF: 18.3)杂志上发表名为Quantifying m6A and Psi Modifications in the Transcriptome via Chemical-Assisted Approaches的研究[1]。

主要结果

m6A：第一个可逆的RNA修饰

N6 -甲基腺苷 (m6A)是哺乳动物mRNA中最丰富的修饰，也是一种动态、可逆的化学修饰。它由METTL3-METTL14-WTAP甲基转移酶复合物和FTO和ALKBH5等去甲基化酶协同调节 (图1b)。通过与不同的RNA结合蛋白(“阅读器”)相互作用，m6A被发现影响多种过程，如选择性剪接，mRNA易位，翻译效率和mRNA稳定性。m6A的分子调控最终导致生理和病理状态的改变。近年来大量研究表明，m6A通过对m6A书写器、阅读器和擦除器的基因操作，参与多种生物学过程，包括母-合子转换、性别决定、精子产生、干细胞分化、神经发育、肿瘤发生、病毒感染等。    

图1. mRNA中m6A的化学结构和Ψ修饰

m6A的化学标记

一种称为m6A-SAC-seq的方法，采用了类似的碘化和环化反应，但去掉了细胞预处理步骤 (图3a)。在m6A-SAC-seq中，利用MjDim1酶在m6A和A中加入一个烯丙基，经过后续的碘化和环化反应，m6A会转化为N1,N6 -乙醇腺嘌呤 (N1,N6-cyc-m6A)，在逆转录过程中突变率高，而A的产物突变率低 (图3b)。MjDim1的序列偏好导致不同的反应效率，导致不同的突变率 (从10%到60%)。因此，m6A-SAC-seq中的m6A定量需要使用具有不同m6A组分的spike-in标准的校准曲线。m6A-SAC-seq在不同细胞系中鉴定了超过10 000个具有不同化学计量的m6A位点，以及单核细胞生成过程中的动态m6A谱。值得注意的是，该技术只需要30 ng的mRNA或rRNA缺失的RNA。

m6A-ORL-seq使用NO/O2将m6A氧化为NO- m6A (图3c)。然后使用二氧化硫硫脲(TDO)将NO-m6A还原为N6 -NH2-m6A (Am6A)， Am6A可以自发转化形成腙，该腙可以用生物素分子标记，然后被链霉亲和素珠捕获 (图3d)。m6A- ORL-seq在HEK293T细胞中检测到数千个m6A峰。在此过程中，其他碱基也会发生不同程度的脱氨基，导致映射比例降低。此外，反应效率较低可导致假阴性位点。   

在对m6A进行化学标记的同时，由于m6A中N6-甲基的惰性，对所有的反应策略都提出了挑战。我们需要更高效的化学或酶来标记m6A，并在全转录组水平获得准确的m6A测量值。    

图3. m6A-SAC-seq和m6A-ORL-seq的化学反应和工作流程的插图

使用肼和亚硫酸氢盐的定量测序方法    

除了CMC，其他的化学反应也被提出可以选择性标记Ψ而不是RNA中的典型U。例如，与丙烯腈的选择性氰基乙基化或甲基乙烯基砜 (MVS)与Ψ的反应生成N1-取代的加合物，并且这两种反应都已经在Ψ检测中使用质谱进行了探索 (图5d,e)。然而，它们在开发转录组范围的ψ测序中的效用仍然不确定，因为这种反应的加合物在RT期间与A配对，就像常规的U一样，并且在测序期间不产生新的信号。此外，在MVS反应中尽量减少对U的明显交叉反应是至关重要的。    

图5. 碳二亚胺和肼辅助测序方法的插图          

结论及展望

我们的团队开发了几种测序技术来研究这些表观转录组标记，包括m6A， Ψ， m1A和m6Am。其中，我们最近开发了两种基于化学反应性的m6A和Ψ在转录组中的绝对定量方法，以区分和测量这两种修饰。在GLORI中，我们使用乙二醛和亚硝酸盐来介导常规腺苷的高效脱氨，而m6A不受影响，因此可以高效和无偏倚地检测单碱基分辨率和m6A修饰的绝对定量。在CeU-seq和PRAISE中，我们使用不同的化学方法来实现全转录组的选择性标记和检测Ψ。CeU-seq是基于叠氮化物衍生的碳二亚胺化合物，而PRAISE利用亚硫酸氢盐的独特活性Ψ。PRAISE导致开环Ψ-亚硫酸氢盐加合物的形成，并在测序过程中定量检测Ψ作为1-2 nt缺失信号。由此产生的碱基分辨和化学计量信息扩展了我们对转录组中RNA修饰的理解。特别是，RNA甲基化组的定量信息对于表征RNA修饰的动态和可逆性质至关重要，例如在环境应激或发育过程中。此外，碱基分辨率和化学计量信息可以极大地促进对基因表达调控重要的功能性修饰位点的分析和表征，特别是当一种修饰类型可能在特定转录本中具有多种甚至相反的功能时。总而言之，定量分析方法提供了修饰的化学计量信息，这对研究RNA修饰的调控作用至关重要。本文将重点介绍本课题组开发的m6A和Ψ的定量测序技术，回顾近年来m6A和Ψ检测的化学辅助反应的进展，并讨论转录组图谱技术在RNA修饰中的挑战和未来的机遇。              

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.accounts.3c00436          

参考文献

1.Zhang Meiling,Xiao Ye,Jiang Zhe et al. Quantifying mA and Ψ Modifications in the Transcriptome via Chemical-Assisted Approaches.[J] .Acc Chem Res, 2023, undefined: undefined.    

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

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