自 2022 年 5 月疫情爆发以来，猴痘在世界范围内广泛传播，威胁人类健康。今年 6 月份以来，我国猴痘病例骤增，国家卫健委已将猴痘纳入乙类传染病管理。引发此次疫情的猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）属于痘病毒科（Poxviridae family）正痘病毒属（Orthopoxvirus genus），是一种大型、有包膜、双链 DNA 病毒。该家族还有两个熟知的成员，痘苗病毒（vaccinia virus）和天花病毒（variola virus）。DNA 复制机器尤其是 DNA 聚合酶是抗正痘病毒药物的重要靶标，该复合物高分辨率结构的解析能够为抗猴痘药物和疫苗的开发提供关键的结构基础。
大部分 DNA 病毒在宿主细胞核内进行基因组的复制，而包括猴痘病毒在内的痘病毒的基因组复制在宿主胞质中完成，其 DNA 复制所需的关键蛋白因子主要由病毒基因组编码，包括 DNA 聚合酶 F8（猴痘病毒和痘苗病毒同源蛋白命名有一定差异，本文出现的蛋白因子均按猴痘病毒系统命名）、DNA 解旋酶/引物酶 E5、尿嘧啶 DNA 糖苷酶（uracil-DNA glycosidase，UDG）E4、与 E4 共同组成聚合酶复制持续性因子（processivity factor）异源二聚体的 A22 以及多功能磷酸化蛋白 H5 等。F8 是 DNA 聚合酶复合物的核心催化亚基，但只能合成小于 10 碱基的小片段产物，A22-E4 二聚体与 F8 形成稳定三元复合物，可以增强聚合酶复制的持续性，因此该三元复合物也被认为是痘病毒的 DNA 聚合酶全酶。此外，UDG E4 可以识别并切除 DNA 中的尿嘧啶单碱基突变并启动 DNA 修复途径。UDG 作为必需因子整合到聚合酶全酶中是痘病毒聚合酶所特有的，这种 DNA 合成和尿嘧啶碱基搜索/切除两个过程耦合的机制尚不明确 (Moss, 2013)。H5 是一种多功能蛋白，也是痘病毒 DNA 复制的必需因子，但针对 H5 在 DNA 复制过程中的分子机制还完全不清楚 (Boyle et al., 2015; McCraith et al., 2000)。
2023 年 12 月 7 日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心高宁团队在 Molecular Cell 杂志最新一期发表题为 Structural insights into the assembly and mechanism of monkeypox virus DNA polymerase complex F8-A22-E4-H5 的研究论文，解析了猴痘病毒 DNA 聚合酶全酶四元复合物不同功能状态的高分辨率结构，阐释了这些病毒复制因子在 DNA 复制过程中的分子机制。
围绕 DNA 聚合酶 F8 和 UDG E4 的功能，该工作通过在复合物中加入不同 DNA 底物的方式，捕捉到 F8-A22-E4-H5 四元复合物不同的构象状态，包括聚合酶在工作过程中为维持复制保真性需要不断转换的经典的「open」和「closed」两种构象状态，以及 UDG E4 结合特异性底物（包含 dU 碱基的 DNA）的催化后构象。作者对这些复合物样品分别进行了冷冻电镜结构解析，最高分辨率达到 2.7 Å（图 1）。F8、A22 和 E4 以 1:1:1 形式存在，而 H5 以四聚体形式结合在复合物中。A22 含有四个结构域，呈 U 型结构分布。作为脚手架蛋白，A22 同时介导了三个功能元件 F8、E4 和 H5 的整合，是聚合酶四元复合物组装的核心元件。
图 1 猴痘病毒 DNA 聚合酶 F8-A22-E4-H5 四元复合物
冷冻电镜结构（A-B）及模式图（C）
UDG E4 结合在单链模板 DNA 区域，位于聚合酶 F8 酶活中心上游（图 1C）。在添加有 E4 特异性 DNA 底物（-7 位为尿嘧啶，dU-7）的四元复合物结构中，可以看到 U 碱基被切除（图 2A-B），形成一个无碱基的位点，表明聚合酶中的 E4 具有 UDG 酶活性，也再次从结构证明了痘病毒中 DNA 尿嘧啶单碱基修复和 DNA 合成过程是耦合在一起的。不同状态的结构分析表明 E4 和 F8 的两个活性中心之间具有 7-10 nt 的间隔（图 1C）。同其它 UDG 类似，以往的 E4 结构和功能研究主要以 dsDNA 底物为研究对象。作者首次获得了 E4 结合有 ssDNA 的结构，发现 E4 结合和作用于 ssDNA 的机制与 dsDNA 类似（图 2B-C）。
图 2 E4 和 ssDNA（A-B）以及 dsDNA（C）
底物之间的相互作用比较
原核生物和真核生物经典的 DNA 聚合酶中的复制持续性因子 PCNA 结合在聚合酶活性中心下游的 dsDNA 区域（图 3A），环绕 dsDNA 防止 DNA 底物的脱落。在猴痘病毒聚合酶四元复合物结构中，已知的复制持续因子 A22-E4 结合在活性中心上游的模板 ssDNA 区域（图 1C），在分子机制上与 PCNA 完全不同。该工作的结构分析认为，A22-E4 可能一方面通过 E4 与 ssDNA 的结合特性促进聚合酶与 DNA 底物的结合，另一方面 A22、E4 以及 F8 的部分结构域共同组成了一个封闭的环，环绕 ssDNA 区域防止 DNA 底物的脱落，从而增加聚合酶的复制可持续性（图 1C）。
图 3 H5 四聚体和 PCNA 在 DNA 聚合酶复合物中的结合位点比较
尽管 H5 是一个必需复制因子，它的分子角色一直不甚清楚。在四元复合物结构中，两个 H5 二聚体进一步形成四聚体。四聚体通过一个末端与 A22 互作从而锚定在聚合酶全酶复合物中，同时以半圆形式环绕 dsDNA。有趣的是，H5 四聚体在痘病毒聚合酶中结合 DNA 的位置与 PCNA 结合 DNA 的位置类似，都位于酶活中心下游的 dsDNA 区域，表明 H5 可能也具有促进复制可持续性的功能（图 3）。该工作进一步结合生化实验验证了 H5 在复制过程中的这一功能。
在本论文撰写及同行评议过程中，施一/高福团队、董长江/张郑宇团队、鄢仁鸿团队先后报道了猴痘病毒 F8-A22-E4 三元复合物的结构 (Li et al., 2023; Peng et al., 2023; Xu et al., 2023)，展示了三元复合物的亚基组织及其与 DNA 底物互作的分子细节。这些工作未涉及到此前功能未知的必需复制因子 H5，也缺少 UDG E4 和 DNA 底物之间互作的结构信息。本项工作通过一系列高分辨率的 F8-A22-E4-H5 结构和功能实验，揭示了 H5 四聚体增强聚合酶的持续性的分子功能，证明了 E4 在聚合酶复合物中具有碱基切除的催化活性。有意思的是，领域的前期工作表明痘病毒聚合酶不具备跨损伤合成活性（translesion synthesis）(Boyle et al., 2011)，表明 E4 在 ssDNA 模板上切除 U 碱基后产生的无碱基位点还需要进一步修复，否则将会影响四元复合物中 F8 所介导的 DNA 合成，这暗示着病毒完整的复制体还可能包括更多的碱基切除修复通路的因子。总体上，本项工作和其他团队最近发表的相关工作一起为理解痘病毒独特的 DNA 复制分子机制提供了重要的结构和功能信息。值得一提的是，该论文提供的
被选为了当期杂志的封面（图 4）。
图 4 Molecular Cell 当期（Volume 83, Issue 23）的封面
封面图展示了猴痘病毒 DNA 聚合酶 F8 在病毒因子 A22、E4 和 H5 的帮助下进行 DNA 复制的分子机制。其中两条螺旋缠绕的树藤分别代表病毒基因组的模板 DNA 链和新生 DNA 链；建筑工人代表 F8；红色安全带代表 A22-E4，安全脚蹬代表 H5，强调了 A22-E4 和 H5 分别以不同的分子机制增强 F8 的 DNA 复制可持续性。
高宁教授和李宁宁副研究员为本文的共同通讯作者，生命科学学院 2019 级博士研究生王笑涵为本文第一作者，前沿交叉学院 2022 级博士研究生马靓雯（昌平实验室研究生项目）也参与了这项工作。本研究得到了生命科学联合中心、国家自然科学基金、科技部重点研发计划、昌平实验室的经费支持。这项工作的冷冻电镜样品检查和数据收集主要在北京大学冷冻电镜平台完成，部分数据在水木未来（北京）科技有限公司收集。北京大学高性能计算平台、生命科学学院仪器中心及国家蛋白质基础设施（北大分平台）为本项目提供了重要的技术支撑。
参考文献：
Boyle, K.A., Greseth, M.D., and Traktman, P. (2015). Genetic Confirmation that the H5 Protein Is Required for Vaccinia Virus DNA Replication. J Virol 89, 6312-6327.
Boyle, K.A., Stanitsa, E.S., Greseth, M.D., Lindgren, J.K., and Traktman, P. (2011). Evaluation of the Role of the Vaccinia Virus Uracil DNA Glycosylase and A20 Proteins as Intrinsic Components of the DNA Polymerase Holoenzyme. J Biol Chem 286, 24702-24713.
Li, Y., Shen, Y., Hu, Z., and Yan, R. (2023). Structural basis for the assembly of the DNA polymerase holoenzyme from a monkeypox virus variant. Sci Adv 9, eadg2331.
McCraith, S., Holtzman, T., Moss, B., and Fields, S. (2000). Genome-wide analysis of vaccinia virus protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 4879-4884.
Moss, B. (2013). Poxvirus DNA replication. Cold Spring Harb Perspect Biol 5.
Peng, Q., Xie, Y., Kuai, L., Wang, H., Qi, J., Gao, G.F., and Shi, Y. (2023). Structure of monkeypox virus DNA polymerase holoenzyme. Science 379, 100-105.
Xu, Y., Wu, Y., Zhang, Y., Fan, R., Yang, Y., Li, D., Zhu, S., Yang, B., Zhang, Z., and Dong, C. (2023). Cryo-EM structures of human monkeypox viral replication complexes with and without DNA duplex. Cell Res 33, 479-482.
研究组介绍
高宁：
北京大学生命科学学院教授、北京大学-清华大学生命科学联合中心研究员，博士生导师
实验室研究领域：
高宁实验室主要致力于阐明细胞内大型蛋白-核酸复合物形成的分子机器的精细结构及工作分子机制，近年来的科研工作着重于核糖体的生物生成（ribosome biogenesis）、蛋白质生物合成的调控、DNA 复制起始调控等重要基础生物学过程。实验室主要采用冷冻电镜三维重构的方法分析大型复合物的高分辨结构，辅助遗传学、细胞生物学、生化分子生物学手段回答大分子机器在功能执行过程中的机制性问题。
李宁宁：
北京大学生命科学学院副研究员
实验室研究领域：
实验室围绕着生命科学的核心内容，主要运用冷冻电镜技术研究与重大生命过程相关的分子机器的结构和功能，探索重要的基础生物学机制问题及相关的人类重大疾病的发生机制。近年来, 实验室的科研工作聚焦于核酸-蛋白复合物分子机器及组成复杂的大型蛋白复合物。实验室的重要研究领域包括：
（1）病原体的核糖体是很多抗菌药物的天然靶点，同时人源核糖体生物生成（ribosome biogenesis）也在多种人类肿瘤细胞中异常上调，并且和肿瘤转移的能力正相关。实验室以细菌、酵母、人源细胞系作为模型，研究人类病原体、模式生物以及人类核糖体的生物组装机制，不同核糖体结合蛋白在蛋白翻译中的新颖调控功能和分子机制，以及潜在药物靶标的发现；
（2）DNA 复制是分子生物学的核心环节，DNA 复制的紊乱也是众多肿瘤的一项标志性特征。实验室研究真核生物 DNA 复制起始过程的蛋白质分子机器的结构和工作机制。
（3）实验室同时也和众多课题组紧密合作，包括临床科学家，研究人类重大疾病治疗靶点的结构和机制。
转自：“丁香学术”微信公众号
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