华盛顿大学张米琴教授Matter：壳聚糖多孔支架，实现神经干细胞体外培养！

神经干细胞

中枢神经系统的创伤和神经源性疾病通常会导致神经组织的永久性损失、终身残疾、发病率，并对患者的生活质量产生毁灭性影响。目前还没有能够完全治愈的治疗方法。随着人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术的进步，细胞疗法已成为治疗这些疾病最有前景的选择之一。在这其中，来源于hESCs或hiPSCs的神经干细胞（NSCs）及其祖细胞可以取代丢失的细胞，重建神经营养和稳态活性，并消除与人工植入物和供体组织移植相关的问题。然而，成年人拥有的人类神经干细胞（hNSCs）通常数量非常少，这些细胞存在于大脑中以维持大脑稳态，但正常的内源性神经过程在患病的神经系统中会发生退化情况。因此，使用同种异体或自体hNSCs被认为是十分必要的。临床前研究和临床试验表明，给予干细胞或分化细胞可以恢复神经发生和功能。然而，细胞治疗通常需要每位患者使用数十亿个临床级细胞才能发挥疗效。

神经干细胞（来源：网络）

研究显示，体外生产hNSCs在三维（3D）微环境中效率最高。而建立有利微环境的策略很大程度上源于模仿天然干细胞小生境。然而，由于缺乏对hNSC微环境的固有时间、空间生物化学和物理特性的全面了解，以及对存在于微环境中的异质细胞群体之间固有的复杂相互作用的全面理解，人类干细胞的最佳微环境仍然部分难以捉摸。对健康人体组织取样的困难也限制了对小生境的分析，尤其是对hNSCs的分析。在开发的3D基质中，Matrigel是小鼠细胞外蛋白混合物的提取物，是传统hNSC培养方案中最普遍的基质。然而，Matrigel在治疗细胞制造中的适用性受到其可变和不明确组成的限制。目前还没有一种不含异种的3D材料可以在无饲养物和化学定义的条件下支持hNSC的规模化增殖扩张。

3D壳聚糖支架

近期，华盛顿大学张米琴教授等人报道了hNSCs在由医用级壳聚糖制成的多孔支架中在化学限定条件下的扩增行为。作者研究了壳聚糖支架的浓度、组成、机械和结构性能对hNSC自我更新的影响，以确定调节hNSC多能维持的材料性能。研究显示，高浓度的壳聚糖支架有利于细胞粘附和增殖，丰富多能细胞群体，抑制分化群体的存活。转录和蛋白质组学分析都表明，这种3D微环境诱导了跨膜受体和细胞骨架相关蛋白的变化，这些蛋白支持hNSC代谢活性，从而实现自我更新。该支架提供了可扩张增殖的3D培养平台，从而有望实现hNSC的成本效益生产。相关工作以“3D chitosan scaffolds support expansion of human neural stem cells in chemically defined condition”为题发表在Matter。

【文章要点】

一、壳聚糖微孔支架

为了制备壳聚糖支架，作者将医用级壳聚糖粉末在2%–4%乙酸溶液中均匀化，然后在多孔板中冷冻干燥，从而制备出与细胞培养程序兼容的支架尺寸（图1）。该支架的质量和微观结构在培养基中长期孵育后也不会发生明显变化，适合长期培养应用。力学性能分析发现，这些支架覆盖了广泛的生理相关弹性模量。在干燥状态下，最软支架的杨氏模量为4.1±0.9kPa，最硬支架则为782.2±242.4kPa。支架在水合作用下软化后，其杨氏模量随着组分含量的变化在1.2±0.4 kPa-100.2±34 kPa范围内波动。进一步的实验则表明，由较高壳聚糖含量制成的支架产生了具有较高弹性模量的基质，该基质可提供更好的粘附性，从而支持hNSC的增殖。此外，壳聚糖浓度越高则意味着支架表面具有更多的氨基基团，更有利于细胞的粘附和增殖。

图1 支架的微结构表征

二、hNSCs在支架中的增殖能力

为了研究hNSCs的自我更新能力，作者从3D支架和2D对照中提取细胞，并通过流式细胞术分析细胞活力和增殖以及hNSC标记物，包括SOX1、SOX2和巢蛋白。细胞增殖标志物Ki67的分析证实了，在低浓度壳聚糖支架中细胞展现出较慢的生长动力学，而在6CS（壳聚糖含量为6 wt%）支架样品外，其他支架类型均导致细胞Ki67表达降低。而SOX1+/Ki67+群体的比较进一步验证了6CS和4CS支架维持了NSC和增殖蛋白的更一致的表达（图2）。总之，较高的壳聚糖浓度支持细胞粘附、均匀的细胞扩散和极化形态，这与较高的增殖率和自我更新能力息息相关。

图2 壳聚糖支架可作为神经干细胞的培养环境

三、干细胞多能性

有趣的是，在所有3D支架中存活的细胞都显示出多能蛋白表达，这表明这些3D支架可能为hNSC群体提供培养选择。NSC多能标记物，核SOX2和巢蛋白，在该3D支架种高度表达，表明支架可以支持hNSC的长期维持。此外，壳聚糖支架可能抑制少突胶质细胞分化和神经元成熟。从6CS支架培养物中收集的细胞与标准2D培养物一样保持增殖和自我更新能力（图3）。

图3 支架中的细胞可维持多能性

【结论与展望】

项研究证明，由原始医用级壳聚糖制成的多孔支架能够在化学定义的条件下作为hNSC扩增和自我更新的优选3D培养基质。转录和蛋白质组学分析显示，这些支架表面所存在的细胞-细胞和细胞-ECM结合相互作用可能示调节hNSC自我更新的主要原因。这些3D壳聚糖支架采用简单而稳健的工艺制备，为大量生成hNSC提供了理想的可扩展解决方案。更重要的是，壳聚糖是一种已经在临床上应用的多功能生物聚合物，可以快速转化为临床级干细胞生产材料。此外，这些壳聚糖3D多孔支架也可用于其他各种干细胞研究以及临床前和临床应用。

转自：“高分子科学前沿”微信公众号

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